Date of Award

12-2022

Document Type

Dissertation

Degree Name

Doctor of Philosophy in Biomedical Sciences

Department

Biochemistry

First Advisor

Farah Mustafa

Second Advisor

Tahir Aziz Rizvi

Abstract

The mouse mammary tumor virus (MMTV) is a milk-borne infectious agent capable of inducing mammary tumors primarily and to some extent, T-cell leukemias/lymphomas in mice. While MMTV has typically been employed to investigate fundamental processes in breast cancer initiation and progression, very little is known about the virus-host interplay during this process. MicroRNAs (miRNAs) are renowned master regulators of the transcriptome that influence key cellular activities, including anti-viral pathways that combat incoming viral infections. A recent study from our group revealed that unlike some retroviruses like bovine leukemia virus (BLV), MMTV does not encode virally-encoded miRNAs (v-miRs); rather, it perturbs the expression of the host miR-17-92 cluster in MMTV-induced mammary tumors. The miR-17-92 cluster is also known as OncomiR-1 since it is often observed to be dysregulated in cancers. These findings prompted us to investigate the role of miR-17-92 cluster during MMTV replication. The present work identifies a novel anti-viral role of the miR-17-92 cluster in MMTV replication where its cluster member miR-92a targets the full-length MMTV genomic RNA, thereby drastically suppressing MMTV replication.
Specifically, miRNASeq analysis of MMTV-expressing cell lines revealed that MMTV led to dysregulation of the miR-17-92 cluster with the expression of miR-92 affected the most amongst all cluster members. Conversely, over-expression of the whole or partial cluster significantly repressed MMTV expression. Interestingly, overexpression of miR-92a cluster member alone resulted in MMTV repression to the same extent as observed with the whole cluster. This suggested that miR-92a could be the major anti-viral component of the miR-17-92 cluster regulating MMTV replication. This hypothesis was tested using an anti-sense oligo-based as well as a plasmid-based approach to suppress miR-92a. Inhibition of miR-92a by either of these methods led to recovery of MMTV gene expression. Furthermore, deletion or substitution of the miR-92a seed sequence within the whole cluster resulted in rescue of MMTV expression. Since miRNAs function by directly targeting specific mRNAs to repress gene expression, we asked whether the miR-17-92 cluster, and in particular miR-92a, had the potential to target the MMTV genome. Towards this end, we used the STarMir bioinformatics tool to predict miRNA binding sites on the MMTV genome. Based on the density of the predicted miRNA binding sites, the MMTV gag gene was identified as a potential target of the cluster. Therefore, the gag gene was cloned into a dual luciferase vector fused to the luciferase gene to further investigate its direct interaction with the miR-17-92 cluster. Our results reveal that both the entire cluster as well as miR-92a alone resulted in suppression of the Gag-luciferase fusion gene expression, demonstrating that the MMTV gag region was indeed a direct target of the miR-17-92 cluster, and in particular, miR-92a. Thus, our study provides the first evidence demonstrating the biological influence of host miRNAs in controlling MMTV replication.

Significance: This observation is of great significance since MMTV-induced tumors share high similarity with human breast cancer, while the MMTV/mouse model is the only animal model system to study breast cancer initiation, progression, and development. Moreover, MMTV is also increasingly being implicated in human breast cancer, leukemias/lymphomas, and biliary cirrhosis due to its potential zoonosis into humans. Thus, understanding how host miRNAs modulate MMTV replication is critical since it could lead to the development of potential miRNA-based therapeutics to thwart MMTV replication in human, if proven true, similar to the drug Miravirsen, that is in clinical trials targeting human chronic hepatitis C virus infection.

Arabic Abstract


مجموعة الأورام للعائل miR-17-92 تعمل على التحكم العكسي بدورة حياة فيروس الـ MMTV عن طريق استهداف الحمض النووي الريبي الجينومي عبر miR-92a

فيروس الاورا م الثديية (MMTV) هو فيروس معدي ينتقل عن طريق الحليب وله القدرة على إحداث أورام الثدي بشكل أساسي بالإضافة الى سرطان الدم / الأورام اللمفاوية في الفئران. بينما يتم استخدام فيروس الـ MMTVعادةً للتحقيق في العمليات الأساسية في بدء سرطان الثدي وتطوره، لا يُعرف سوى القليل جدًا عن تفاعل العائل مع الفيروس أثناء هذه العملية.

MicroRNAs (miRNAs) هي منظمات رئيسية معروفة والتي تؤثر على الأنشطة الخلوية الرئيسية، بما في ذلك المسارات المضادة للفيروسات التي تكافح العدوى الفيروسية. كشفت دراسة حديثة من مجموعتنا أنه على عكس بعض الفيروسات الارتجاعية مثل فيروس الـ(BLV)، لا يقوم فيروس الـ MMTV بتشفير miRNAs الفيروسي (v-miRs)؛ بدلاً من ذلك، فإنه يعمل على اضطراب وتثبيط التعبير للـ miR-17-92المضيفة الخاصة بالعائل في أورام الثدي التي يسببها فيروس الـ MMTV. تُعرف مجموعة الـ miR-17-92أيضًا باسم OncomiR-1 لأنه غالبًا ما يُلاحظ أنه غير منتظم في السرطانات. دفعتنا هذه النتائج إلى التحقيق في دور مجموعة الـ miR-17-92أثناء دورة حياة فيروس الـ MMTV. بناء على البحث الحالي تم اكتشاف دورًا جديدًا مضادًا للفيروسات لمجموعة miR-17-92 في دورة حياة فيروس الـ MMTVحيث يستهدف عضو المجموعة miR-92a الحمض النووي الريبي الجينومي للـ MMTVكامل الطول، وبالتالي يقمع بشكل كبير نسخ الـMMTV.

على وجه التحديد، كشف تحليل miRNASeq للخلايا المعبرة عن الـ MMTV أن فيروس الـ MMTVيعمل على حدوث خلل في مجموعة miR-17-92 وعلى وجه الخصوص التعبير عن miR-92 كان الأكثر تأثراً بين جميع أعضاء المجموعة. على العكس من ذلك، فإن الإفراط في التعبير عن الكتلة الكاملة أو الجزئية يؤدي الى قمع التعبير للـ MMTV بشكل كبير. ومن المثير للاهتمام، أن الإفراط في التعبير عن عضو المجموعة miR-92a وحده أدى إلى قمع الـ MMTV بنفس القدر الذي لوحظ مع المجموعة بأكملها. يشير هذا إلى أن miR-92a يمكن أن يكون المكون الرئيسي المضاد للفيروسات في مجموعة miR-17-92 التي تنظم النسخ المتماثل للـMMTV. تم اختبار هذه الفرضية باستخدام نهج مضاد قائم على oligo وكذلك نهج قائم على البلازميد لقمع miR-92a. أدى تثبيط miR-92a بأي من هاتين الطريقتين إلى استعادة التعبير الجيني للـ MMTV. علاوة على ذلك، أدى حذف أو استبدال تسلسل الـ miR-92aداخل المجموعة بأكملها إلى إنقاذ تعبير الـ MMTV. نظرًا لأن miRNAs تعمل من خلال استهداف mRNAs محددة بشكل مباشر لقمع التعبير الجيني، سألنا عما إذا كانت مجموعة miR-17-92، وعلى وجه الخصوص miR-92a، لديها القدرة على استهداف جينوم الـMMTV. لتحقيق هذه الغاية، استخدمنا أداة StarMir المعلوماتية الحيوية للتنبؤ بمواقع ربط miRNA على جينوم الـ MMTVاستنادًا إلى كثافة مواقع ربط miRNA المتوقعة، تم تحديد جين MMTV gag كهدف محتمل للمجموعة. لذلك، تم استنساخ جين gag في ناقل لوسيفيراز مزدوج مدمج في جين luciferase لمزيد من التحقيق في تفاعله المباشر مع مجموعة miR-17-92. كشفت نتائجنا أن كل من المجموعة بأكملها وكذلك miR-92a وحدها أدت إلى قمع التعبير الجيني للـGag-luciferase، مما يدل على أن منطقة MMTV gag كانت بالفعل هدفًا مباشرًا لمجموعة miR-17-92، وعلى وجه الخصوص miR-92a. وبالتالي، توفر دراستنا الدليل الأول الذي يوضح التأثير البيولوجي للعوامل المضيفة miRNAs في التحكم في نسخ الـ MMTV.

الأهمية: هذه الملاحظة ذات أهمية كبيرة لأن الأورام التي يسببها فيروس الـ MMTVتتشابه بدرجة كبيرة مع سرطان الثدي البشري، ويعتبر نموذج MMTV/ الفأر هو النظام النموذجي الحيواني الوحيد المعتمد لدراسة بدء سرطان الثدي وتطوره. علاوة على ذلك، يتم أيضًا تورط فيروس الـ MMTV بشكل متزايد في سرطان الثدي البشري، وسرطان الدم / الأورام اللمفاوية، والتليف الصفراوي بسبب احتمالية الإصابة بالفيروس في البشر. وبالتالي، فإن فهم كيفية تعديل miRNAs الخاصة بالعائل لنسخ الـ MMTVأمر بالغ الأهمية لأنه يمكن أن يؤدي إلى تطوير علاجات محتملة تستند إلى miRNA لإحباط نسخ الـ MMTVفي الإنسان، إذا ثبتت صحته، على غرار عقار Miravirsen، أي في التجارب السريرية التي تستهدف التهاب الكبد المزمن البشري الناتج عن عدوى فيروس سي

Download

Share

COinS