Date of Award

12-2019

Document Type

Thesis

Degree Name

Master of Science (MS)

Department

Medical Microbiology and Immunology

First Advisor

Gulfaraz Khan

Abstract

Epstein-Barr virus (EBV) is a human herpes virus that infects and persists in > 90% of human adults, generally without causing disease. However, EBV has oncogenic properties and is associated with several malignancies of epithelial and lymphoid origin. The details of the molecular steps leading to these different malignancies are poorly understood. It is believed that some of the EBV latent gene products are involved. Two small EBV-encoded RNAs referred to as EBER1 and EBER2 have been shown to be expressed in all forms of EBV latent infection. These non-polyadenylated and non-protein-coding RNAs are by far the most abundant transcripts expressed in EBV infected cells (>106 copies), but their function remains unknown. Although not directly involved in cell transformation, several studies have reported that these RNAs may be involved in inhibiting apoptosis and providing a proliferative advantage to EBV-infected cells. The molecular mechanisms involved in these processes are unclear. The aim of this study was to investigate the role of EBER1 in cell proliferation. We prepared stable EBER1 transfectants of different cell types (epithelial, B-cell, and T-cell), together with corresponding control cell lines transfected with the control plasmid only. After confirming that EBER1 was expressed in all EBER1 transfected cells, we investigated their proliferative properties using a range of different approaches and methodologies. Cell proliferation was measured by trypan blue exclusion assay, after subjecting the cells to either normal growth requirements or serum-deprived conditions. ATP activity, as an indicator of cell proliferation, was measured using a Glo-cell viability assay. A soft agar assay was used to determine the colony-forming ability of EBER1 transfected cells. The molecular mechanism underlying EBER1 induced proliferation was assessed by Real-Time qPCR, immunocyte chemistry, and western blot for known proliferation markers, namely Ki67, PCNA, and MCM2. Finally, in an attempt to understand the potential intracellular pathways that may be activated in EBER1 transfected cells, we examined for the expression of genes involved in cell proliferation using microarray methodology. The results from these investigations indicated that EBER1 transfected cells, compared to controls, had higher ATP activity, proliferated at a significantly higher rate, expressed higher levels of RNAs and proteins associated with cell proliferation, and formed larger and more colonies in soft agar. Our study also suggested that EBER1 could be inducing some of these changes by triggering the production of pro-inflammatory cytokines and anti-apoptotic signals.

Comments

فيروس "ابستين بار" هو الهربس البشري الذي يصيب ويقيم في أكثر من 90 ٪ من البشرالبالغين، وبشكل عام من دون أن يتسبب في أمراض. وبالرغم من ذلك فإن له خصائص سرطانية ويتشارك مع الكثير من الأورام اللمفاوية والظهارية. والتفاصيل الجزيئية المؤدية إلى هذه الأورام لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. ويعتقد أن بعض المنتجات في المرحلة الكامنة لفايروس ابستين تلعب دورا في ذلك. هناك نوعان من الحمضين النووين الريبوزيين، يطلق عليهما 1EBER و 2 EBER ينتجان في كل المراحل الكامنة لفيروس ابستين بار.تعتبر هذه الرناوات الغير مشفرة وغير المشبعة بالبروتين هي أكثر النسخ وفرة في الخلايا المصابة بفيروس ابستين بار ( > 10⁶ نسخة( ، لكن وظائفهم إلى الآن غير معروفة. على الرغم من عدم مشاركتهم بشكل مباشر في تحول الخلايا، فقد أفادت عدد من الدراسات أن هذه الرناوات قد تشارك في تثبيط موت الخلايا وتوفير ميزة التكاثر للخلايا المصابة بفايروس ابستين بار. الآليات الجزيئية المشاركة في هذه العمليات غير واضحة الهدف من هذه البحث هو دراسة دور 1 EBER في تكاثر الخلايا. أعددنا أنواع مختلفة من ( الخلايا المستقرة الخلايا الظهارية والخلاي B و الخلايا التائية ) التي تحتوي على ال EBER1 ‘ بالمقابل مع خلايا التحكم التي تحتوي على البلازميد فقط. بعد التأكد من التعبير الجيني لل EBER1 في جميع الخلايا الحاملة ال EBER1 ، درسنا خصائص التكاثر باستخدام مجموعة من الأساليب والمنهجيات المختلفة. تم قياس تكاثر الخلايا عن طريق اختبار ،trypan blue بعد تعريض الخلايا لمتطلبات النمو الطبيعي أو سيروم منزوع الوسط. تم قياس الطاقة، كمؤشر على تكاثر الخلايا، باستخدام - Glo- .cell viability assay تم استخدام soft agar لتحديد قدرة الخلايا الحاملة ال EBER1 في تشكيل مستعمرة. تم تقييم الآلية الجزيئية الكامنة وراء حث EBER1 في التكاثر بواسطة الزمن الحقيقي لتفاعل البلمرة المتسلسل، والكيمياء الخلوية المناعية و western blot للدلالات البروتينية المعروفة، مثل Ki67 و PCNA و 2 .MCM في محاولة منا لفهم المسارات المحتملة داخل الخلايا التي قد يتم تنشيطها في الخلايا التي تحتوي على EBER1 ‘ درسنا تعبير عن الجينات المشاركة في تكاثر الخلايا باستخدام تقنية رقائق الحمض النووي الدقيقة. أشارت نتائج هذه الدراسة إلى أن الخلايا الحاملة لل EBER1 مقارنة بالغير الحاملة لهذا الحمض، كانت ذات طاقة أعلى، وتكاثرت بمعدل أعلى، وعبرت عن مستويات أعلى من الأحماض النووية الريبوزية والبروتينات المرتبطة بتكاثر الخلايا وشكلت مستعمرات أكبر. اقترحت دراستنا أيضًا أن EBER1 يمكن أن يحفز بعضًا من هذه التغييرات من خلال إطلاق cytokines المؤيدة للالتهابات والإشارات المضادة لموت الخلايا.

Download
COinS