Shaima Akhlaq

Date of Award

11-2017

Document Type

Thesis

Degree Name

Master of Science (MS)

Department

Biochemistry

First Advisor

Farah Mustafa

Second Advisor

Tahir A. Rizvi

Third Advisor

Gulfaraz Khan

Abstract

Retroviral genomes have been shown to contain regulatory sequences at the 3’ end of their genomes that have been implicated in critical steps of the viral life cycle, including nucleocytoplasmic RNA export, RNA stability, and post-nuclear export functions, such as translation. Recently mouse mammary tumor virus (MMTV) has been shown to encode Rem protein and its cis-acting cognate sequence located at the 3’ of the genome, the Rem-responsive element (RmRE). The binding of Rem to RmRE facilitates the export of genomic RNA (gRNA) from the nucleus to the cytoplasm. Using an expression system, our previous results have shown that unspliced MMTV Gag/Pol RNA could be exported out of the nucleus in the absence of a functional Rem/RmRE regulatory system, but its translation required a constitutive transport element (CTE) from Mason-Pfizer monkey virus that can facilitate its expression. Considering that RmRE is located at the junction of env/3’ LTR, a region common to all MMTV mRNAs, 3’ RmRE has the potential to affect all mRNAs. Based on these observations, it was hypothesized that an additional cis-acting control element, a putative 5’ RmRE, could be present at the 5’ end of the MMTV genome, facilitating gRNA nuclear export by distinguishing between the unspliced from the spliced mRNAs, whereas the 3’ RmRE on the other hand, could facilitate translation of all other mRNAs, including the unspliced RNA.

To address this hypothesis, a series of deletion and substitution mutations were introduced between the major splice donor (mSD) and Gag ATG, a region that should exclusively be present in the gRNAs. These mutant clones were tested in transient and stable transfections to determine their effect on gRNA nuclear export, stability, and translation. Our results revealed severe defects in the expression of both unspliced gRNA as well as spliced mRNAs, suggesting that a cis-acting element could be present at the 5’ end of the MMTV genome modulating gene expression. Interestingly, nuclear export of the gRNA as well as its stability was not affected by the mutations. Furthermore, a complete abrogation of Gag and Env protein expression was observed, suggesting translational defects in the affected set of mutants. Quantitative real-time PCR analysis revealed that the mutants were severely compromised in the expression of genomic as well as the spliced RNAs in the nucleus, suggesting a possible transcriptional defect that compromised the expression of Gag and Env proteins. We next explored the possibility of the cis-acting element serving as a potential transcription factor binding site. Careful sequence analysis of this region revealed the presence of mirror repeats that could act as potential recruitment sites for transcription factors. Preliminary in silico analysis has predicted multiple transcription factors of the zinc finger family that could interact with this element in a sequence-specific manner. Overall, this study suggests that MMTV contains a cis-acting element at the 5’ end of the genome which helps regulate gene expression by facilitating transcription of MMTV mRNAs.

Comments

لقد اوضحت الدراسات أن الجينومات الفيروسية تحتوي على تسلسل تنظيمي في نهاية الجينوم end) ‘3 ) والتي تلعب دورا اساسيا في دورة الحياة الفيروسية، بما في ذلك نقل الحمض النووي الريبي الى السيتوبلازم، استقرار الحمض النووي الريبي، ووظائف ما بعد النقل من النواة مثل الترجمة. في الآونة الأخيرة، تبين ان فيروس الاورام الثديية (MMTV) يحتوي على بروتين ال (Rem) وبعض من عناصره كال (RmRE) في نهاية الجينوم end) ‘3 ) , وقد وجد ان ترابط هذا البروتين مع عنصره (RmRE) يسهل عملية نقل الحمض النووي الريبي الجيني ( gRNA ) من النواة إلى السيتوبلازم

باستخدام نظام التعبير الجيني، أظهرت نتائجنا السابقة أن الحمض النووي الغير مقسم (Unspliced) والذي يحتوي على بروتينات ال Gag/Env يمكن نقله من النواة في غياب نظام ،Rem/RmRE ولكن ترجمتها تتطلب عنصر النقل التأسيسي ( CTE ) من فيروس (MPMV) و التي يمكن أن تسهل ترجمتها الى البروتينات الخاصة بها. وبالنظر إلى أن عنصر ( RmRE) يقع عند تقاطع ، env/3’ LTR , وهي منطقة مشتركة لكل الاحماض عنص ( RmRE) يقع عند تقاطع ، env/3’ LTR ، وهي منطقة مشتركة لكل الاحماض النووية لفيروس ال MMTV, فأن هذا العنصر لديه القدرة على التأثير على جميع هذه الاحماض. واستنادا إلى هذه الملاحظات، فقد تم وضع فرضية ان هناك عنصر (5’ RmRE) والذي يسهل عملية نقل الحمض النووي من النواة عن طريق التمييز بين الحمض النووي المقسم وغير المقسم. على الجانب الاخر فان عنصر ال (3’RmRe) يسهل من عملية ترجمة الاحماض النووية بما في ذلك الحمض النووي الغير المقسم. وللتحقق من هذه الفرضية، تم إدخال سلسلة من الطفرات على الحمض النووي الفيروسي ما بين الحذف اوالاستبدال في المنطقة ما بين (mSD) و بداية بروتين ال Gag وهي المنطقة التي ينبغي أن تتواجد حصريا في الحمض النووي .وقد تم اختبار هذه الطفرات في عملية ال transfection العابرة والمستقرة لتحديد تأثيرها على نقل واستقرار وترجمة الحمض النووي.

كشفت نتائج التجارب لهذه السلسلة من الطفرات عن وجود تأثير سلبي حاد في التعبير الجيني لكل من الحمض النووي الريبي المقسم وغير المقسم، مما يشير إلى أن هناك عنصر اخر مهم متواجد في نهاية الجينوم (5’end) هو المتحكم الرئيسي في هذه العملية. ومن المثير للاهتمام، ان عملية نقل واستقرار الحمض النووي الريبي لم تتأثر بهذه الطفرات. وعلاوة على ذلك، فقد لوحظ إلغاء كامل للتعبير الجيني لبروتينات ، Gag , Env ، مما يشير إلى التأثيرات السلبية لهذه الطفرات على عملية الترجمة الخاصة بهذه البروتينات. وكشف التحليل الكمي لل PCR ان هذه الطفرات اثرت وبشكل كبير على التعبير الجيني الخاص بالحمض النووي الريبي المقسم وغير المقسم مما يرجح احتمالية تناقص كبير في عملية النسخ والتي اثرت على تكوين بروتينات ال .Gag, Env

وقد بحثنا لاحقا في امكانية ان يلعب عنصر ال cis بمثابة عامل النسخ الاساسي. وقد كشف التحليل المتسلسل الدقيق لهذه المنطقة عن وجود تكرار المرآة والتي يمكن أن تكون بمثابة مواقع التوظيف المحتملة لعوامل النسخ. وتوقع التحليل الأولي (in silico) عن وجود عدة عوامل للنسخ من عائلة الزنك والتي يمكن أن تتفاعل مع هذا العنصر بطريقة محددة التسلسل. وعموما، تشير هذه الدراسة إلى أن فيروس (MMTV) يحتوي على عنصر ال (cis) في نهاية الجينوم ’end) 5 ) والذي يساعد على تنظيم التعبير الجيني من خلال تسهيل عمليات نسخ الحمض النووي الريبي لفيروس .(MMTV)

Download
COinS