Date of Award

11-2023

Document Type

Thesis

Degree Name

Master of Science in Environmental Science

Department

Biology

First Advisor

Dr. Nayla Munawar

Second Advisor

Iltaf Shah

Abstract

Fructosyltransferase enzymes are involved in the production of fructans, which are polymers of fructose and naturally present in many foods like fruits, vegetables, legumes, and cereals. Fructans with short chain lengths are called Fructooligosaccharides (FOS), which are small dietary fibers having low caloric values and are known as “prebiotics”. Fructans have a broad range of applications in the food, pharmaceutical, cosmetics, and chemical industries. They have unique physiochemical properties and functionalities depending on the source of enzyme used for their production. The present study aimed at the utilization of a recently discovered unique fructosyltransferase enzyme from an extremely halophilic microorganism, Haloarcula marismortui, to produce novel fructans for biotechnological applications. A 1.4 kb fructosyltransferase (ftf) gene from Haloarcula marismortui was cloned in a pET15b vector having a 6xHis Tag at its N-terminus and expressed in the mesophilic host, E.coli, under different growth conditions to optimize the expression of the recombinant enzyme. The expression of the ftf gene in the E.coli BL21(DE3) strain produced an insoluble protein in the form of inclusion bodies. However, soluble, and active recombinant protein has been successfully obtained in the E.coli BL21(DE3) Rosetta strain, which provides rare codons for the expression of recombinant proteins in a heterologous host. Almost 90% pure enzyme was obtained by affinity purification using Ni-NTA column. The detailed biochemical characterization (pH dependence, salt dependence, thermostability, and metal ions stability) of the recombinant enzyme showed that the enzyme works optimally in 2.5 M NaCl and is stable in 1 M, NaCl for 10 days at 4 oC. The pH and temperature optima are 7 in KPi buffer and 40 oC, respectively. The enzyme lost its activity and stability when heated at 60oC and above for 5 minutes. None of the metals tested supported the enzyme activity. The enzyme synthesized more product in the presence of 1 M sucrose compared to 500 mM under optimum assay conditions. The TLC analysis of the product exhibited the presence of a polymer which was found to be inulin by further analysis through NMR. Production of the recombinant halophilic enzyme in a larger quantity to obtain more product for the detailed analysis of linkages among fructose monomers to explore its biotechnological potential remains a challenge for the future.

Arabic Abstract

تحديد الخصائص الكيمياء حيوية لإنزيم ناقل لل فركتوز من كائنات محبة للبيئة شديدة الملوحة الهالواركولا ماريزمورتوي، لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية

تشارك الإنزيمات الناقلة للفركتوز في إنتاج الفركتان، وهي عبارة عن سلسة جزيئات طويلة من الفركتوز و توجد بشكل طبيعي في العديد من الأطعمة مثل الفواكه والخضروات والبقوليات والحبوب . و يُطلق على الفركتان ذات السلسلة القصيرة اسم Fructooligosaccharides (FOS)، وهي ألياف غذائية صغيرة ذات سعرات حرارية منخفضة وتُعرف باسم " بريبيوتك ". لدى الفركتان مجموعة واسعة من التطبيقات في مجالات الصناعات الغذائية والدوائية ومستحضرات التجميل والصناعات الكيميائية، كما تتميز أيضًا بخصائص ووظائف فيزيائية وكيميائية فريدة تعتمد على مصدر الإنزيم المستخدم لإنتاجها . تستهدف الدراسة الحالية استخدام انزيم فريد و مختص بنقل وحدة الفركتوز ، لقد تم اكتشافه مؤخرًا من كائنات مجهرية محبة للبيئات شديدة الملوحة، تُدعى هالواركولا ماريزمورتوي، لإنتاج الفركتانات الجديدة لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية . تم استنساخ جين Fructosyltransferase (ftf) سعته 1.4 كيلو بايت من الهالواركولا ماريزمورتوي المحبة للملوحة في ناقل (pET15b) له علامة في الهيستامين السادس في الطرف N وقد تم التعبير عنه في مضيف ذو طبيعة معتدلة E.coli، في ظل ظروف نمو مختلفة لتحقيق التعبير الأمثل للانزيم ذو العلامة الجينية المعدلة . إن التعبير عن جين ftf في سلالة BL21 E.coli أنتج بروتينًا غير قابل للذوبان في شكل أجسام متضمنة. ومع ذلك، تم الحصول بنجاح على البروتين المؤتلف القابل للذوبان والنشط في سلالة BL2 Rosetta E.coli، التي توفر كودونات نادرة للتعبير عن البروتينات المؤتلفة في مضيف غير متجانس. تم الحصول على ما يقرب من 85٪ من الإنزيمات النقية عن طريق التنقية بالمصاهر ة باستخدام عمود Ni-NTA. أظهر الوصف البيوكيميائي التفصيلي (بالاعتماد على درجة الحموضه ، الملح، والثبات الحراري، واستقرار الأيونات المعدنية) للإنزيم المؤتلف أن الإنزيم يعمل بالشكل الأمثل في تركيز 2.5M من كلوريد الصوديوم ويظل مستقرًا في 1M من كلوريد الصوديوم لمدة تصل لعشر أيام أيام عند 4 درجات مئوية . القيمة الحمضية الأمثل هي 7 في محلول Kpi و40 درجة مئوية لدرجة الحرارة، على التوالي. فقد الإنزيم نشاطه وثباته عند تسخينه عند درجة حرارة 60 درجة مئوية فما فوق لمدة 5 دقائق؛ لم تدعم أي من المعادن التي تم اختبارها نشاط الإنزيم . أيضًا، قام الإنزيم بتصنيع كمية أكبر من المنتج في وجود 1M سكروز مقارنةً بتركيز 500 mM تحت ظروف الفحص المُثلى. أظهر تحليل TLC للمنتج وجود بوليمر و الذي اتضح انه انيولين من خلال تحليله بالرنين المغناطيسي النووي . مازالت الإنزيمات المحبة للملوحة تُنتَج بِكميات أكبر للحصول على المزيد من منتجاتها، ثم تحلل روابطها بشكل مفصل بين وحدات الفركتوز الأحادية و ذلك لاستكشاف إمكاناتها في مجال التكنولوجيا الحيوية التي تمثل تحديًا للمستقبل .

Download
COinS