Date of Award

4-2018

Document Type

Thesis

Degree Name

Doctor of Philosophy (PhD)

Department

Biochemistry

First Advisor

Dr. Ahmed H. Hassan Al-Marzouqi

Abstract

In eukaryotes, DNA is wrapped around histone proteins forming a highly compact structure, the chromatin. All DNA-based processes must occur within the complex organization of the chromatin, and this requires modulation of its structure when needed. This is accomplished by covalent histone modifications that alter histone-DNA contacts, as well as through the actions of ATP-dependent chromatin remodelers. These multi-subunit complexes play major roles in transcription regulation, replication and repairing DNA damage. This thesis aims to characterize a poorly studied member of the SWI/SNF family of ATPases/helicases, Irc20, from Saccharomyces cerevisiae. Previously, Irc20 has been shown to be involved in recombinational repair and to possess ubiquitin ligase (E3) activity. The human homolog of Irc20, SHPRH, has also been implicated in repair via the poly-ubiquitylation of PCNA, the sliding clamp of the DNA polymerase. Loss of heterozygosity in the region containing the SHPRH gene is seen in a wide variety of cancers. In this study, using purified Irc20, we showed that it possesses DNA and nucleosome binding activities, as well as an ATP-hydrolyzing activity. However, despite homology to Snf2 catalytic domain, Irc20 did not have the ability to alter chromatin structure. Using point mutations in different Irc20 domains, we identified that the increased recombination centers observed in irc20 null mutants is dependent on both its ATPase and ubiquitin ligase activities. Consistent with this, we observed higher recruitment or retention of the recombination repair factor Rad52 at a single induced double strand break in Δirc20 mutant, suggesting a regulatory role for Irc20 in DNA repair. Furthermore, we observed a previously unidentified function for Irc20 in regulating the levels of the endogenous yeast 2-μm plasmid. In irc20 null mutant, we observed a three to four-fold increase in 2-μm levels, forming high molecular weight forms in a manner dependent on homologous recombination. We suggest this is, at least partially, through regulating the levels of Flp1 recombinase since we observed higher levels of Flp1 in Δirc20 mutant after shutting off expression from a repressible promoter. Collectively, our results show a regulatory role for Irc20 in recombination underlying its role in stabilizing the genome and regulating the 2-μm plasmid levels.

Arabic Abstract

في حقيقيات النواة، يتم لف الحمض النووي حول بروتينات الهيستون التي تشكل بنية مدمجة للغاية، الكروماتين. يجب أن تحدث جميع العمليات القائمة على الحمض النووي ضمن التنظيم المعقد للكروماتين، وهذا يتطلب تعديل هيكله عند الحاجة. ويتم تحقيق ذلك من خلال تعديلات هيستون التساهمية التي تغير من اتصالات الهستون بالحمض النووي، وكذلك من خلال تصرفات مقلدات الكروماتين المعتمدة على ATP. تلعب هذه المجمعات متعددة الوحدات الفرعية أدواراً رئيسية في تنظيم النسخ وتكرار وإصلاح أضرار الحمض النووي. تهدف هذه الأطروحة إلى وصف العضو الذي تمت دراسته بشكل ضعيف في عائلة SWI/SNF من ATPases/helicases، Irc20، من الخميرة Saccharomyces cerevisiae. في السابق، تم إثبات أن Irc20 يشارك في إصلاح التكاثر وأن يمتلك نشاط ubiquitin ligase E3. كما تم توريط نظير Irc20 في الإنسان، SHPRH، في إصلاح الحمض النووي عبر poly-ubiquitylation من PCNA، مشبك الانزلاق لبوليميراز الحمض النووي. وينظر إلى فقدان متغايرة الزيجوتية في المنطقة التي تحتوي على جين SHPRH في مجموعة واسعة من أنواع السرطان. في هذه الدراسة، باستخدام Irc20 منقى، أظهرنا أنه يمتلك أنشطة ربط الحمض النووي ونواة الجسيمات، بالإضافة إلى نشاط ATP-hydrolyzing. ومع ذلك، على الرغم من انه مشابه لـSnf2، لم يكن لدي Irc20 القدرة على تغيير بنية الكروماتين. باستخدام طفرات في نقاط مختلفة في Irc20، حددنا أن زيادة مراكز إعادة التركيب الذي لوحظ في الخلايا التي تنقص جين irc20 يعتمد على كل من أنشطة الـ ATPaseوالـ ubiquitin ligase. تماشياً مع ذلك، لاحظنا زيادة في توظيف أو الاحتفاظ بعامل إصلاح إعادة التركيب Rad52 عند حدوث كسر مزدوج للحبل مزدوج في متحولة Δirc20، مما يشير إلى وجود دور تنظيمي لـ Irc20في إصلاح الحمض النووي. علاوة على ذلك، لاحظنا وظيفة غير معروفة سابقا لـ Irc20في تنظيم مستويات من البلازميد 2 ميكرون الخاص بالخميرة. في الخلايا التي تنقص irc20، لاحظنا زيادة ثلاثة إلى أربعة أضعاف في مستويات البلازميد 2 ميكرون، وتشكيل أشكال ذات وزن جزيئي عالي بطريقة تعتمد على إعادة التركيب المتماثل. نحن نقترح أن هذا، على الأقل جزئيا، من خلال تنظيم مستويات Flp1 recombinase لأننا لاحظنا مستويات أعلى من Flp1 في الخلايا التي تنقص جين irc20 بعد إغلاق التعبيرالجيني من مشغل قابل للاغلاق.
بشكل جماعي، تظهر نتائجنا دورًا تنظيميًا لـ Irc20 في إعادة التركيب التي تقوم على أساس دورها في تثبيت الجينوم وتنظيم مستويات البلازميد 2 ميكرون.

Download
COinS