INSIGHTS INTO THE PACKAGING OF MOUSE MAMMARY TUMOR VIRUS (MMTV) GENOMIC RNA BY IDENTIFYING PR77ᴳᴬᴳ BINDING SITES INVOLVED DURING ITS SELECTIVE ENCAPSIDATION

Author

Akhil ChameettachalFollow

Date of Award

6-2021

Document Type

Dissertation

Degree Name

Doctor of Philosophy (PhD)

Department

Medical Microbiology and Immunology

First Advisor

Tahir A. Rizvi

Second Advisor

Farah Mustafa

Abstract

Selective encapsidation and/or packaging of retroviral genomic RNA (gRNA) by Gag during retrovirus assembly is a crucial step for generating infectious virus particles. Despite having been studied extensively, the mechanism by which the retroviral Gag precursor selects and packages the retroviral genome remains largely unclear. Therefore, to understand the molecular mechanism(s) of mouse mammary tumor virus (MMTV) gRNA packaging, as a first step, expression of full-length recombinant Pr77^Gag -His6-tag fusion protein in bacteria was done. The recombinant Gag protein was then purified from the soluble fractions of bacterial cultures using immobilized metal affinity chromatography (IMAC) and size exclusion chromatography (SEC). The purified recombinant Pr77^Gag -His6-tag protein retained the ability to assemble in vitro into virus-like particles (VLPs). In parallel, the VLPs made in vivo following expression of the recombinant Pr77^Gag -His6-tag fusion protein in eukaryotic cells could package MMTV subgenomic RNAs. Next, RNA binding and footprinting assays using the purified protein and in cell gRNA packaging experiments identified two critical, non-redundant Pr77^Gag binding sites. These binding sites include: i) a stretch of purines in a hairpin loop immediately adjacent to the dimerization initiation site (DIS) hairpin, thus forming a bifurcated stem-loop structure and ii) the primer binding site (PBS). Despite the presence of the packaging signals on both unspliced and spliced RNAs, Pr77^Gag specifically bound to unspliced RNA, which is the only one that can adopt the native bifurcated stem-loop structure. Together this study demonstrates the minimal packaging elements at both sequence and structural levels required to initiate MMTV gRNA packaging. Unlike purine rich regions, the direct involvement of PBS in retroviral gRNA packaging has not been documented in retroviruses. These findings add to the knowledge of retroviral gRNA packaging and assembly, making it a potential target for novel therapeutic approaches as well as the development of safer gene therapy vectors.

Arabic Abstract

يعد التجميع الانتقائي و/ أو تغليف الحمض النووي الريبوزي الجيني للفيروسات الارتجاعية (gRNA) بواسطة بروتين الـGag أثناء عملية تكوين الفيروس، خطوة حاسمة لتوليد جزيئات الفيروس المعدية. على الرغم من دراستها على نطاق واسع، إلا أن الآلية التي من خلالها يختار بروتين الـGag. الحمض النووي الريبوزي الخاص بالفيروس من بين الاحماض النووية الريبوزية الأخرى المتواجدة في الخلية، غير واضحة إلى حد كبير. لذلك، لفهم الآلية (الآليات) الجزيئية لتجميع الحمض النووي الريبوزي (gRNA)‏ لفيروس الـ(MMTV)، كخطوة أولى، تم التعبير عن بروتين الاندماج Pr77^Gag-His₆-tag كامل الطول في البكتيريا. ثم بعد ذلك، تم تنقية البروتين من الأجزاء القابلة للذوبان باستخدام كروماتوغرافيا تقارب ايونات المعدن الثابت (IMAC) وكروماتوغرافيا الاستبعاد عن طريق اختلاف الحجم (SEC).
‏احتفظ البروتين المنقى Pr77^Gag-His₆-tag بالقدرة على التجميع في المختبر في جزيئات تشبه الفيروسات (VLPs). وفي نفس السياق الموازي، يمكن لجزيئات الVLPs المصنوعة بعد التعبير عن بروتين الاندماج الـ Pr77^Gag-His₆-tagفي الخلايا حقيقية النواة أن تقوم بتجميع الحمض النووي الريبوزي الخاص بفيروس MMTV. بعد ذلك، حددت اختبارات ربط الحمض النووي الريبوزي (gRNA) وتجارب البصمة باستخدام البروتين المنقى وتجارب تجميع الـgRNA الخلوية الخلوية موقعين مهمين وغير متكررين لربط الـPr77^Gag تشمل مواقع الربط هذه: 1) امتداداً من البيورينات في شكل حلقة مجاورة مباشرة لحلقة موقع البدء (DIS)، وبالتالي تشكل بنية حلقة جذعية متشعبة و 2) موقع الربط التمهيدي (PBS). على الرغم من وجود إشارات التجميع على كل من RNAs المقسمة وغير المقسمة، فإن Pr77^Gag مرتبط على وجه التحديد بالـRNA غير المقسم، وهو الوحيد الذي يمكنه التعرف والارتباط ببنية الحلقة الجذعية الأصلية المتشعبة.
توضح هذه الدراسة الحد الأدنى من عناصر التجميع الانتقائي على المستويين التسلسلي والهيكلي المطلوب لبدء تجميع الـgRNA بفيروس الـMMTV، على عكس المناطق الغنية بالبيورين، لم يتم توثيق المشاركة المباشرة للـPBS في تجميع الحمض النووي الريبوزي في الفيروسات الارتجاعية. تضيف هذه النتائج إلى المعرفة بعمليات التجميع الانتقائي في الفيروسات الارتجاعية، مما يجعلها وسيلة محتملة للطرق العلاجية الجديدة بالإضافة إلى القدرة على تطوير نواقل للعلاج الجيني أكثر فعالية وأمان.

Recommended Citation

Chameettachal, Akhil, "INSIGHTS INTO THE PACKAGING OF MOUSE MAMMARY TUMOR VIRUS (MMTV) GENOMIC RNA BY IDENTIFYING PR77ᴳᴬᴳ BINDING SITES INVOLVED DURING ITS SELECTIVE ENCAPSIDATION" (2021). Dissertations. 187.
https://scholarworks.uaeu.ac.ae/all_dissertations/187