Date of Award

11-2020

Document Type

Thesis

Degree Name

Master of Science (MS)

Department

Biology

First Advisor

Dr. Mohammed Akli Ayoub

Second Advisor

Dr. Rabah lratni

Third Advisor

Dr. Suleiman AI-Sabah

Abstract

The renin angiotensin system (RAS) through its hormone angiotensin (AngII) and the protease thrombin are two major physiological regulators of vascular and renal functions. RAS is involved in the regulation of blood pressure and water-electrolytes hemostasis, while thrombin has a crucial role in platelets activation and thrombosis. The interplay between these two systems at the physiological and the pathophysiological levels has been documented in many studies. However, such an interplay at the pharmacological level between the AngII and thrombin receptors still has not been explored. Our study aimed to explore the interplay between the AngII type 1 receptor (AT1R) and the thrombin protease-activated receptor (PAR1), which both belong to the G protein-coupled receptors (GPCR) family, using transfected human embryonic kidney (HEK293) cells. For this various bioluminescence resonance energy transfer (BRET) technology-based analytical and biochemical assays were used. BRET saturation and co-immunoprecipitation demonstrated the physical interaction between AT1R and PAR1 indicating their heterodimerization in vitro. Moreover, dose response and real-time kinetic experiments revealed a functional AT1R-PAR1 interaction characterized by a positive allosteric modulation and transactivation of AT1R activity by PAR1 towards its coupling to Gαq protein, inositol phosphate (IP1) pathway, and β-arrestin recruitment. This was contrasted with a transinhibition of AT1R internalization as well as its endosomal trafficking upon PAR1 activation. Together, our data demonstrated for the first time the physical and functional interaction between AT1R and PAR1 which may constitute a molecular and mechanistic rationale for the well-known interplay between RAS and thrombin. These findings are of extreme importance in the field of drug discovery. Targeting the pathological conditions involving RAS and thrombin opens promising perspectives for the identification of selective and safer drugs by considering AT1R-PAR1 heterodimers as a potential druggable molecular entity.

Comments

يُعدُّ كل من نظام الرنين-أنجيوتينسين عن طريق هرمونه، الأنجيوتينسين 2 ( AngII ) ونظام أنزيم الثرومبين ( thombin ) ذوا أهمية بالغة في الحفاظ على توازن وصحة جهاز القلب والأوعية الدموية ووظائف الكلى. حيث يعمل نظام الرنين-أنجيوتينسين على المحافظة على توازن ضغط الدم و الماء والأملاح، بينما يقوم أنزيم الثرومين بدور أساسي كعامل تخثر ومساعد على تنشيط الصفائح الدموية. العديد من الدراسات وثّقت التفاعل ما بين هذين النظامين على مستوى الفسيولوجيا وارتباط كلاهما بالعديد من الأمراض. لكن، حتى الآن لم تتم دراسة هذا التفاعل على مستوى المستقبلات لهذين النظامين. لهذا، سَعت دراستنا لفهم إن كان هذا التفاعل بين كل من هذين النظامين يحدث على مستوى المستقبلات الخاصة بهم، مستقبلات هرمون الأنجيوتنسين 2 (AT1R) ومستقبلات أنزيم الثرومبين ( 1 PAR ) ، واللذان ينتميان لعائلة المستقبلات المقترنة ببروتين-ج وذلك باستخدام خلايا إنسانية من الكلى الجنينية ( 293 HEK ) معدّلة جينيا بحيث تحتوى على هذه المستقبلات. لإتمام هذه الدراسة قمنا باستخدام تقنية بريت ( BRET ) وتقنيات كيميائية حيوية. حيث أثبتت نتائجنا التقارب الجزيئي بين مستقبلات الأنجيوتينسين 2 ومستقبلات الثرومبين باستخدام تقنية بريت للتشبُّع BRET Saturation ) assay ) بالإضافة لتقنية الترسيب المناعي immunoprecipitation) - (Co والتي بدورها أكّدت أنهما مترابطان سويا ويشكلان مركبا في التجارب المخبرية. إضافة إلى ذلك، كل من تجارب الجرعة بالإستجاب (Dose Response) وتجارب الحركية حقيقية الوقت (Real-Time Kinetics أثبتت بدورها تفاعل هذا الترابط وظيفيا بالارتباط ببروتين-ج (Gαq) ، تنشيط مسار إينوزيتول أحادي الفوسفات ( 1PI ) وتنشيط بروتينات بيتا أرّيستين 2 (β-arrestin 2) حيث كان هذا عن طريق تنشيط مستقبلات الأنجيوتينسين 2 بواسطة مستقبلات الثرومبين (Transactivation) ، إضافة لكون مستقبل الثرومبين معدّل تفارغي إيجابي (positive allosteric modulator) لمستقبلات الأنجيوتينسين. علاوة على ذلك، أظهرت مستقبلات الثرومبين تثبيط للإدخال الخلوي لمستقبلات لأنجيوتينسين 2 ومساراتها. دراستنا هذه أثبتت لأول مرة التقارب الجزيئي والتفاعل الوظيفي بين مستقبلات الأنجيوتينسين 2 ومستقبلات الثرومبين، والتي بدورها يمكن أن تكون السبب في التفاعل بين نظام الرنين-أنجيوتينسين والثرومبين. وتعد هذه النتائج ذات أهمية كبيرة في مجال علم الأدوية لعلاج الأمراض التي يلعبان فيها هذين النظامين دورا في تفاقهما، بهدف الحصول على نتائج مبشرة لاستكشاف أدوية ذات فعالية أكبر وآثار جانبية أقل عن طريق أخذ هذا التفاعل على مستوى المستقبلات وترابطها بعين الاعتبار.

Download

Share

COinS