Date of Award

5-2015

Document Type

Thesis

Degree Name

Master of Science in Medical Sciences (MSMS)

Department

Medical Microbiology and Immunology

First Advisor

Tahir A. Rizvi

Second Advisor

Dr. Ahemd Al-Marzouqi

Third Advisor

Dr. Farah Mustafa

Abstract

Employing a combination of genetic and biochemical approaches, we have recently shown that the 5’ end of MPMV genome (from the first nucleotide in R up to 120 nt of Gag) contains a number of sequence and structural motifs important for MPMV gRNA packaging and dimerization. A distinguishing feature of the higher order structure of MPMV packaging signal RNA is two long-range interactions (LRI) between U5 and Gag complementary sequences, LRI-I and LRI-II, which are phylogenetically conserved among different MPMV strains. These LRIs have been suggested to play a role in stabilizing the RNA secondary structure of the 5’ UTR sequences that are important for MPMV RNA packaging. The overall RNA secondary structure of this region is further architecturally held together by three other stem loops (SL3, Gag SL1, and Gag SL2) comprising of sequences from distal parts of the 5’ UTR and Gag, excluding Gag sequences involved in forming U5-Gag LRIs. To provide functional evidence for the biological significance of U5-Gag LRIs and the three stem loops to the MPMV life cycle, a series of mutations were introduced in these structural motifs and their effects on MPMV RNA packaging and propagation tested in a genetic trans-complementation assay. Test of LRIs mutants revealed that disrupting the complementary base pairing of the LRI structural motifs affected both gRNA packaging and propagation, confirming their functional role during MPMV life cycle. Our results further revealed that the two LRIs function at different levels. Specifically, LRI-I functions at the secondary structural level, whereas LRI-II functions at both the primary sequence as well as in its native structural context levels. Finally, Mutational analysis of the sequences involved in viii forming SL3, Gag SL1, and Gag SL2 revealed that they do not play crucial role at individual levels during MPMV gRNA packaging and propagation. These findings suggest that U5-Gag LRIs have a more important architectural role in stabilizing the structure of the 5’ UTR sequences, while the three stem loops (SL3, Gag SL1, and Gag SL2) may have a more secondary role in stabilizing the overall RNA secondary structure, providing a better understanding of the molecular interactions that take place during MPMV gRNA packaging.

Comments

التجميع الأمثل للمادة الوراثية (RNA) لفيروس Mason-Pfizer Monkey Virus (MPMV) يعتمد على التفاعلات المحفوظة بعيدة المدى بين سلسلتي الحمض الأميني المكونة ل U5 و Gag لقد أظهرنا مؤخرا من خلال توظيف مزيج من الأساليب الجينية والبيوكيميائية، أن الطرف 5' من جينوم MPMV )من النوكليوتيدات الأولى في R تصل إلى 021 في جين Gag ( يحتوي على عدد من الهياكل العليا و سلاسل نيوكليوتيدات ذات أهمية في عمليتي dimerization و التعبئة والتغليف packaging لجينوم MPMV . ومن السمات المميزة للهياكل العليا المكونة لإشارة التعبئة والتغليف في جينوم MPMV RNA هو اثنين من التفاعلات طويلة المدى ) LRI ( بين U5 وجينوم Gag ،هذه التفاعلات ملقبة ب LRI-I و LRI-II ، والتي وجد أنها محفوظة phylogenetically بين عدد كبير من سلالات MPMV المختلفة. هذا ما اقترح أن هذه التفاعلات LRIs قد تلعب دورا في استقرار و متانة الهيكل الثانوي ل RNA بداية من الطرف 5' في تسلسل UTR التي تعتبر مهمة لعملية التعبئة والتغليف packaging لجينوم MPMV RNA . كما أن متانة هذا الهيكل الثانوي تعتمد بشكل عام على وجود ثلاثة حلقات جذعية stem loops أخرى تسمى ( SL3 ، Gag SL1 ، Gag SL2 ( و تتألف من اقتران سلاسل نيوكليوتيدات من أجزاء من الطرف 5' UTR وجينوم Gag ، باستثناء الأجزاء من جينوم Gag المشاركة في تشكيل تفاعلات LRIs . لتقديم أدلة وظيفية للأهمية البيولوجية لتفاعلات LRIs والحلقات الجذعية الثلاثة في دورة الحياة MPMV خاصة عمليتي تكوين ثنائي الجينوم RNA dimerization و التعبئة و التغليف packaging ، أدخلت سلسلة من الطفرات في هذه الزخارف الهيكلية الثانوية و تم فحص آثارها على عمليتي تكوين ثنائي الجينوم RNA dimerization و التعبئة و التغليف packaging باستخدام genetic trans-complementation assay . وكشف هذا الاختبار أن الطفرات التي تسببت بتعطيل تكون تفاعلات اقتران هياكل ال LRIs قد أثر سلبيا على كل من عمليتي تغليف الجينوم RNA packaging و التكاثر propagation مؤكدا الدور الوظيفي للهياكل العليا الثانوية LRIs أثناء دورة حياة MPMV . وكشفت النتائج التي توصلنا إليها كذلك إلى أن كل هيكل من LRIs تؤدي وظيفتها بطريقة تختلف عن الأخرى. فعلى وجه التحديد، تؤدي تفاعلات اقتران هيكل LRI-I وظيفتها على المستوى الهيكلي الثانوي، في حين أن وظائف تفاعلات اقتران هيكل LRI-II تؤدي وظيفتها بالاعتماد على التسلسل الأساسي للنوكليوتيدات المشاركة في هذا الاقتران بالإضافة إلى الهيكل الثانوي على حد سواء. أخيرا، كشف تحليل الطفرات أن تسلسل النوكليوتيدات المشاركة في تكوين الحلقات الجذعية الثلاثة المسماة ب SL3 ، Gag SL1 ، و Gag SL2 أنها لا تلعب دورا حاسما على المستوى الفردي خلال عمليتي تغليف الجينوم RNA packaging و التكاثر propagation ل MPMV gRNA . هذه النتائج تشير إلى أن تفاعلات اقتران النوكليوتيدات من U5 - Gag المكونة ل LRIs لها الدور المعماري الأكثر أهمية في تحقيق الاستقرار في هيكل تسلسل 5' UTR ، في حين أن الحلقات الجذعية الثلاثة ) SL3 ، Gag SL1 ، و SL2 Gag ( قد يكون لها دور أكثر ثانوية في استقرار الهيكل الثانوي ل MPMV RNA بشكل عام، و بالتالي فإن هذه النتائج توفر فهم أفضل للتفاعلات الجزيئية التي تحدث أثناء عملية تغليف MPMV gRNA مما يساعد على استخدامها بشكل آمن في المستقبل في علاج الأمراض الوراثية gene therapy .

Download
COinS