Date of Award

11-2022

Document Type

Thesis

Degree Name

Master of Medical Sciences (Biochemistry and Molecular Biology)

Department

Biochemistry & Molecular Biology

First Advisor

Ahmed H. Hassan Al-Marzouqi

Abstract

DNA, the basic unit of inheritance, is continuously exposed to numerous endogenous and exogenous damaging agents that compromise its function and adversely impact health. However, the cell has evolved intricate DNA repair mechanisms to mitigate the negative consequences of genomic instability. The repair of DNA double-strand break (DSB) is potentially accomplished by various mechanisms, including homologous recombination (HR). An HR-mediated DSB repair requires controlled regulation of repair proteins to ensure timely function. Posttranslational modifications (PTMs), such as ubiquitylation and SUMOylation, are regulatory mechanisms that significantly fine-tune proteins activities. Central to these processes is Rad52, a conserved oligomeric protein that forms a ring-shaped structure and primarily serves as a target for SUMOylation, stimulated by DNA damage. In Saccharomyces cerevisiae, Irc20 is a SUMO-targeted ubiquitin ligase that plays a pivotal role in controlling Rad52 enrichment at DSB. In fact, the multifunctional mediator of the ubiquitin-proteasome system (UPS), Cdc48 protein, is also important for modulating the levels of Rad52. However, the interaction between these proteins along with the crosstalk of PTM pathways remains to be explored.

This thesis aims to investigate the mechanism of action of Irc20 and Cdc48 in regulating Rad52. In addition, we examine the functional significance of their interaction in the maintenance of genome integrity during DNA repair and beyond. In this study, using purified Irc20 and Rad52, we show that Rad52 is a potential substrate of Irc20 in vivo, and Rad52 SUMOylation triggers its subsequent ubiquitination. In addition, we report a genetic interaction between IRC20 and CDC48 suggesting that Irc20 acts upstream of Cdc48. Furthermore, our work identifies a role of Cdc48 in recycling Rad52 from DSB sites during recombination.

Importantly, we uncover a novel role of Cdc48 in the maintenance of the 2-μm plasmid copy number. Altogether, our findings support a model in which Irc20 facilitates Cdc48 in Rad52 regulation.

Arabic Abstract

التحقق من دور Irc20 و Cdc48 في المحافظة على توازن الحمض النووي للخميرة

الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين DNA جزيء مسؤول عن تخزين وترجمة المعلومات الوراثية في الكائنات الحية. لكنه يتعرض لعدد لا يحصى من العوامل الداخلية والخارجية الضارة التي تُخل بوظيفته. ينجم عن ذلك ظهور طفرات جينية تؤدي إلى اضطرابات تُخل بالصحة. لكن الخلية طورت آليات معقدة لإصلاح الحمض النووي التالف للتخفيف من الآثار السلبية لعدم استقراره. يتم إصلاح كسر الحمض النووي المزدوج (DSB)   بعدة طرق، منها إعادة التركيب المتماثل  (HR). يتطلب إصلاح كسر الحمض النووي المزدوج الدقة في استدعاء وإزالة بروتينات الإصلاح لضمان الوظيفة المناسبة في الوقت المناسب. تعد تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) آليات تنظيمية تعمل على ضبط أنشطة البروتينات بدقة. مركز هذه العمليات هو بروتين قليل القسيمات على شكل حلقة يسمى  Rad52 ، حيث يعمل بشكل أساسي كهدف لعلامات  SUMO بعد تحفيز تلف الحمض النووي. يعتبر رابط اليوبيكويتين Irc20 إنزيم أساسي في استهداف SUMO  حيث يلعب دورًا محوريًا في التحكم في مستويات Rad52 في مواقع كسر الحمض النووي المزدوج في الخميرة Saccharomyces cerevisiae . كما يلعب بروتين Cdc48 وهو الوسيط متعدد الوظائف لنظام يوبيكويتين البروتيازوم  (UPS) دورًا مهمًا لتعديل مستويات Rad52 . لكن التفاعل بين هذه البروتينات مع مسارات PTMs لا يزال غامضًا .

تهدف هذه الأطروحة إلى التحقيق في آلية عمل بروتينات STUbL Irc20و segregase Cdc48 في تعديل مستويات بروتين Rad52 ، فضلاً عن الأهمية الوظيفية لتفاعلهما أثناء إصلاح الحمض النووي التالف للحفاظ على استقرار الجينوم. في هذه الدراسة، باستخدام Irc20 و Rad52 المنقى، أظهرنا أن تنظيم Rad52 عن طريق عملية SUMOylation يساهم في تدهوره لاحقًا وأن Rad52 مستهدف عن طريق Irc20 . كما لاحظنا وجود تفاعل جيني مهم بين Irc20 و Cdc48 يشير إلى أن Irc20 يعمل في اتجاه تيار Cdc48 .وأبرز عملنا أيضًا وظيفة استثنائية ل Cdc48  في إعادة تدوير Rad52 من مواقع DSB أثناء عملية الإصلاح عن طريق إعادة التركيب. ومن إحدى أهم النتائج التي توصلنا إليها هي أن دور بروتين Cdc48 أوسع بكثير مما كان يُفترض سابقًا؛ حيث إنه يتوسط تحقيق التوازن في البلازميد 2 ميكرون. بشكلٍ عام، تدعم النتائج التي توصلنا إليها نموذجًا ينص على أن بروتين Irc20 يسهّل وظيفة Cdc48 لتوج يه مستويات بروتين  Rad52

Download
COinS