Date of Award

12-2021

Document Type

Thesis

Degree Name

Master of Medical Sciences (Biochemistry and Molecular Biology)

Department

Biochemistry & Molecular Biology

First Advisor

Bassam R. Ali

Abstract

Low-density Lipoprotein Receptor Related Protein 6 (LRP6) is a member of the Low-Density Lipoprotein Receptors family (LDLRs) which is involved in the clearance of LDL from the bloodstream and the signaling of the canonical wingless signaling pathway. Several genetic variants in the LRP6 gene have been conclusively associated with cardiovascular diseases (CVDs) and metabolic syndrome. However, the structural and functional implications of those variations have not been fully elucidated. The CVD-associated LRP6 variants could be retained and possibly subjected to Endoplasmic Reticulum Associated Degradation (ERAD), a quality control and adaptive process employed by cells to eliminate misfolded proteins to maintain ER homeostasis. The aim of this project is to investigate the subcellular localization, stability, and transport of ten LRP6 missense variants (p.Lys82Asn, p.Arg360His, p.Tyr418His, p.Asn433Ser, p.Arg473Gln, p.Ser488Tyr, p.Arg611Cys, p.Pro1066Thr, p.Pro1206His, and p.Ile1264Val) associated with CVD. The variants were generated by site-directed mutagenesis, then analyzed by confocal immunofluorescence microscopy, western blotting and Endoglycosidase-H sensitivity and resistance assay. The immunofluorescence and confocal imaging showed that while the wild-type LRP6 is transported to the plasma membrane, several CAD-associated LRP6 variants were not transported to the same level and instead retained in the ER. Analyzing the glycosylation profiles of these variants demonstrated significant lower maturation rates for the mutant proteins in comparison with wild-type. ER retention of CVD-associated LRP6 variants could contribute to their pathogenicity by loss or reduction of LRP6 function and signaling efficiency, which could be further explored by carrying out functional analysis in the future. This study will lead to a better understanding of the pathogenesis of LRP6 missense variations with potential applications in clinical diagnosis and the development of new therapies. The results obtained confirmed the ER retention of several CVD-related LRP6 mutants.

Arabic Abstract

توضيح الآليات الخلوية الأساسية للطفرات الجينية المغلطة في البروتين المرتبط بمستقبل البروتين الدهني المنخفض الكثافة 6 و المرتبطة بأمراض القلب و الأوعية الدموية

البروتين المرتبط بمستقبل البروتين الدهني المنخفض الكثافة 6 (LRP6 ) هو جزء من عائلة بروتينات مستقبل البروتين الدهني المنخفض الكثافة ( LDLR ) ، و هي عائلة لها دور في إزالة البروتين الدهني المنخفض الكثافة من الاوعية الدموية و تأشيرات الخلية المتعلقة ببروتين الدبليو.ان.تي ( Wnt ). بعض الطفرات الجينية في البروتين المرتبط بمستقبل البروتين الدهني المنخفض الكثافة 6 وجدت في مرضى مصابين بأمراض القلب والأوعية الدموية ومتلازمة الأيض. لم يتم عمل دراسات لاستكشاف التأثير الحاصل بسبب هذه الطفرات على تشكيل ووظائف البروتين. قد تسبب هذه الطفرات خللاً في تشكيل البروتين يؤدي إلى منع انتقاله من الشبكة الاندوبلازمية إلى الغشاء الخلوي، وبالتالي تعريض البروتين الحامل للطفرة إلى التفكيك من قبل الشبكة الاندوبلازمية المرتبطة بتدهور البروتين. الهدف من هذه الدراسة هو معرفة تأثير الطفرات الجينية للبروتين المرتبط بمستقبل البروتين الدهني المنخفض الكثافة 6 على تشكيل ووظائف البروتين. تم تنفيذ التطفر نوعي الموقع لاحداث الطفرات في الجين السليم، ثم استخدم الجين الحامل للطفرة في عمل تحليلات التألق المناعي ولطخة ويسترن. أوضحت نتائج التألق المناعي أن عدة طفرات اثرت على موقع البروتين في الخلية وأدت إلى تواجده في الشبكة الاندوبلازمية بدلا من الغشاء الخلوي. كما أظهرت تحليلات لطخة ويسترن أن معدل إتمام انتاج البروتين وإتمام ارتباطه بالغليكوزيل ( Glycosylation ) يتأثران بعدة طفرات وينخفضان للبروتين المتحور مقارنة بالبروتين السليم. هذه الدراسة ستؤدي إلى فهم أفضل عن تأثير الطفرات الجينية في البروتين المرتبط بمستقبل البروتين الدهني المنخفض الكثافة 6 على تشكيل و وظائف البروتين، و علاقتها بأمراض القلب و الأوعية الدموية.

Download
COinS