Date of Award

4-2024

Document Type

Thesis

Degree Name

Master of Science in Molecular Biology and Biotechnology

Department

Biology

First Advisor

Prof. Khaled Amiri

Second Advisor

Dr. Suja George

Abstract

Lettuce (Lactuca sativa L.) is a leafy vegetable consumed worldwide, mainly as a green salad. It is an herbaceous, self-pollinated annual plant of the family Asteraceae. Lettuce is low in calories, fat, and sodium. It is a good source of fiber, iron, folate, and vitamin C. Improving existing lettuce varieties for water use efficiency, photosynthesis efficiency, salt tolerance, increased nutritional content, etc., is the need of the hour, considering that lettuce is a crop ideal for vertical farming in the UAE.

This study aimed to develop a highly efficient in vitro regeneration and Agrobacterium- mediated transformation protocol for a popular lettuce variety, ‘Paris Island cos’ belonging to the romaine type. The study analyzed 11 different tissue culture media- hormone combinations for shoot regeneration efficiency from lettuce cotyledon explants. Murashige and Skoog media supplemented with vitamins, 3% sucrose, 0.1 mg/L BAP, and 0.1 mg/L NAA had the highest shoot regeneration percentage in this study and were used in the Agrobacterium transformations.

The study analyzed the effect of several transformation parameters, such as ‘explant preculture,’ ‘optical density of Agrobacterium culture,’ ‘infection method,’ and ‘time of co-cultivation,’ etc., to optimize the transformation. The highest transformation efficiency of 14% was observed when shallow wounded cotyledon explants from 7-day- old seedlings were transformed under the following conditions: preculture for 24 hours, Agrobacterium optical density of 0.5 at 600 nm, infection time of 10 minutes, and a co- cultivation period of 3 days under 22°C under dark conditions. After optimizing the transformation conditions using a vector harboring the reporter gene RFP, the study further transformed the gene SbSI-1, reported to function in salt and drought tolerance in the halophyte (Salicornia brachiata), and obtained transgenic plants. The expression levels of the transgene were analyzed by quantitative real-time PCR. The study successfully developed an efficient in vitro regeneration and Agrobacterium-mediated transformation protocol for the lettuce variety ‘Paris Island cos’.

Arabic Abstract


تحسين عملية تكون الخلايا النباتية وعملية التعديل الوراثي بواسطة البكتيريا داخل المختبر لنبات الخس (Lactuca sativa)

يعتبر الخس (Lactuca Sativa) من الخضراوات الورقية والتي يتم استهلاكها في جميع أنحاء العالم وبشكل أساسي من ضمن مكونات السلطة الخضراء. وهو نبات عشبي سنوي ذاتي التلقيح ويتبع لفصيلة الستيرايسيات (Asteraceae). ويحتوي الخس على سعرات حرارية قليلة جداً بالإضافة إلى نسبة قليلة من الدهون والصوديوم. كما أنه يعتبر مصدر جيد للألياف والحديد وفيتامين C. إن تحسين أصناف الخس الموجودة حاليأ من حيث تقليل استخدام المياه، وزيادة كفاءة التمثيل الضوئي، وتحمل الملوحة، بالإضافة إلى زيادة المحتوى الغذائي صارت ضرورة ملحة مع الأخذ في الاعتبار أن الخس هو محصول مثالي للزراعة العمودية في دولة الإمارات العربية المتحدة.

تهدف هذه الدراسة إلى تطوير بروتوكول عالي الكفاءة في المختبر لعملية تكوين الخلايا النباتية بالإضافة إلى التعديل الوراثي المطلوب باستخدام البكتيريا (Agrobacterium tumefaciens) على صنف الخس " Paris Island cos " والذي ينتمي إلى نوع رومين (Romaine). قامت الدراسة أيضا بتحليل 11 تركيبة مختلفة من الأوساط الغذائية الزراعية تحتوي على هرمونات تساعد على نمو الأنسجة من أجل تحسين كفاءة الخس على تكوين الخلايا النباتية ونمو أوراق نبات الخس من الورقة الفلقية. الوسط الغذائي والذي يتكون من Murashige and Skoog والفيتامينات، 3% من السكروز، 0.1 ملغ/لتر BAP و0.1 ملغ/لتر NAA أثبت أن لديه أعلى نسبة نمو لأوراق نبات الخس في هذه الدراسة وبالمثل تم استخدم هذا الوسط الغذائي في عملية التعديل الوراثي بواسطة البكتيريا (Agrobacterium tumefaciens).

بالإضافة الى ما سبق فقد قامت الدراسة أيضاً بتحليل تأثير عدد من الدلالات والطرق التي تؤثر على التعديل الوراثي مثل: الزراعة المسبقة للأوراق وتعداد البكتريا وقت الزراعة المشتركة بالإضافة الي طريقة حقن الجين وما إلى ذلك من طرق لتحسين التعديل الوراثي. وقد لوحظ أن أعلى كفاءة تحول للخس بنسبة 14% عندما تم تحويل ورقة الفلقة المجروحة بجروح سطحية على شتلات عمرها 7 أيام تحت الشروط التالية: الزراعة المسبقة لمدة 24 ساعة، تعداد البكتيريا الزراعية (OD) يجب أن تكون 0.5 عند 600 نانومتر، ووقت الإصابة بالعدوى 10 دقائق، وفترة الزراعة المشتركة لمدة 3 أيام على درجة حرارة 22 درجة مئوية في ظل ظروف مظلمة. بعد تحسين ظروف التعديل الوراثي باستخدام ناقل (Vector) والذي يحتوي على الجين المراسل RFP، قامت الدراسة أيضا بتحويل جين مستخدم مسبقا يعمل على تحمل الملوحة والجفاف من نبات الساليكورنيا براكياتا (Salicornia brachiata) والنباتات المعدلة وراثيا باستخدام نفس الجين. تم تحليل مستويات التعبير الجيني في النباتات المعدلة وراثيا بواسطة استخدام Real-time PCR.

نجحت الدراسة في تطوير بروتوكول فعال يساعد على تكون الخلايا النباتية ونجاح عملية التعديل الوراثي داخل المختبر بوساطة (Agrobacterium tumefaciens) لصنف الخس ‘Paris Island cos’.

Download

Included in

Biology Commons

COinS