Date of Award

10-2023

Document Type

Thesis

Degree Name

Master of Medical Sciences (Biochemistry and Molecular Biology)

Department

Biochemistry & Molecular Biology

First Advisor

Bassam R. Ali

Abstract

Pharmacogenomics (PGx) is a relatively new field of study. It links genetics to pharmacology since it deals with the influence of the genetic makeup of the individual on their ability to respond to specific medications. Some of the most important genes in this field, dubbed very important pharmacogenes (VIPs), belong to the cytochrome P450 (CYP) superfamily of drug metabolizing enzymes. The two members of this family that are the main focus of this thesis are CYP2C19 and CYP2D6. They play major roles in the metabolism of numerous medications, and it is therefore imperative that variations within those genes in various populations are detected in an efficient and timely manner, as well as establishing their impact on the function of the encoded enzymes.
In this study, seven variants in CYP2C19 that have been detected in the Emirati population were analysed to determine their potential effects on the enzyme’s activity. Major aims of this thesis were to perform in silico analysis, generate the seven target variants in mammalian expression vectors, express them in mammalian cell lines, and measure the resulting enzyme’s activities. The variants were successfully generated by site-directed mutagenesis using two expression vectors as templates and were expressed in COS and Hek293T cells. However, the enzymatic activity tests using lysates from those cells were inconclusive and, therefore, further analysis, perhaps using different kits, are needed to further establish the impact of those variants.
For CYP2D6, a long-range PCR-based technique was optimized and utilized to detect gene copy numbers using DNA extracted from blood samples isolated from psychiatric patients to determine their CYP2D6 metabolic status. In particular, this test was used to detect if the patients have a deletion star allele (CYP2D6*5) or duplication of CYP2D6. The results indicate that this approach could be used to implement genetic testing to determine CYP2D6 copy numbers in patients requiring medication metabolized by this enzyme.

Arabic Abstract


التحليل الجزيئي والكيميائي لإنزيمات السيتوكروم P450 و2C19 و2D6

علم الأدوية الجينية (PGx) هو مجال دراسة جديد نسبياً. يربط علم الأدوية بالوراثة لأنه يتعامل مع تأثيرالتركيب الجيني للفرد من حيث قدرته على الاستجابة لأدوية معينة. بعض من أهم الچينات في هذا المجال، والتي يطلق ليها اسم الچينات الدوائية المهمة للغاية (VIP) تنتمي إلى عائلة مستقبلات السيتوكروم P450 (CYP) من إنزيمات استقلاب الأدوية. العضوان الرئيسيان في هذه العائلة واللذان تركز عليهم هذه الأطروحة هما CYP2C19 وCYP2D6. لديهما أدواراً رئيسية في استقلاب العديد من الأدوية، ولذا فمن الضروري أن يتم اكتشاف التغيراتداخل هذه الچينات بطريقة فعالة وفي الوقت المناسب، وفهم تأثيرها على وظيفة الإنزيمات المشفرة.
في هذه الدراسة، تم تحليل سبعة متغيرات في CYP2C19 تم اكتشافها في السكان الإماراتيين لتحديد التأثير الذي لديها على نشاط الإنزيم. كان أحد الأهداف الرئيسية لهذا البحث هو إجراء تحليل حوسبي، والتعرف على سبعة متغيرات مستهدفة في نواقل الچينات، والكشف عنها في الخلايا الحيوانية، وقياس أنشطة الإنزيم الناتجة عنها. تم إحداث المتغيرات بنجاح عن طريق الطفرات الموجهة باستخدام نواقل چينية كنماذج وتم ظهورها في خلايا COS و Hek293T. ومع ذلك، كانت اختبارات النشاط الأنزيمي باستخدام lysates من تلك الخلايا غير قاطعة، وبالتالي يلزم إجراء مزيد من التحليلات، ربما باستخدام أدوات مختلفة.
بالنسبة إلى CYP2D6، تم تحسين تقنية PCR طويلة المدى واستخدامها لاكتشاف أعداد نسخ الجين باستخدام الحمض النووي المستخرج من عينات دم المريض لتحديد حالة الوضع الاستقلابي للإنزيم CYP2D6. تم استخدام هذا الاختبار بشكل خاص لتحديد ما إذا كان لدى المرضى أليل حذف نجمة (CYP2D6*5) أو تكرار CYP2D6. تشير النتائج إلى أن هذا النهج يمكن استخدامه لتطبيق الاختبارات الچينية لتحديد أعداد نسخ CYP2D6 في المرضى الذين يحتاجون إلى أدوية يتم استقلابها بواسطة هذا الإنزيم.

Download
COinS