Date of Award

4-2025

Document Type

Dissertation

Degree Name

Doctor of Philosophy in Biomedical Sciences

Department

Genetics & Genomics

First Advisor

Bassam Ali

Abstract

Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) and the neutral amino acid transporter B0AT1, encoded by SLC6A19, are membrane proteins with pivotal roles in human physiology. ACE2 is involved in regulating blood pressure and serves as the cellular entry receptor for SARS-CoV-2, while B0AT1 facilitates amino acid absorption in the intestine. The interplay between ACE2 and B0AT1, particularly their physical interaction and co-expression in the intestine, underscores their relevance in both normal physiology and disease. Dysregulation of these proteins has been implicated in conditions such as hypertension, and Hartnup disease and they have been usurped by SARS-CoV-2 to cause COVID-19. Despite their importance, knowledge gaps remain regarding the impact of naturally occurring ACE2 variants and disease-associated B0AT1 mutations on their biogenesis, trafficking, and function, as well as their roles in disease pathogenesis. The general aim of my PhD thesis was to address some of these knowledge gaps by investigating how specific ACE2 and B0AT1 variants affect their subcellular localization, and interactions. To achieve this, I employed a multidisciplinary approach, including site-directed mutagenesis to generate 39 naturally occurring and structural ACE2 variants and 18 Hartnup disease-causing B0AT1 mutations. The impact of these variants has been analysed using immunofluorescence confocal microscopy, Western blotting, and N-glycosylation profiling to evaluate their effects on subcellular localization and protein maturation. In silico analyses were also conducted to assess binding affinity changes within the [ACE2:B0AT1 super-complex], and drug screening assays were performed to explore modulators of ACE2 maturation as a potential approach to decreasing cell surface ACE2 expression and consequently SARS-CoV-2 viral entry. Our findings revealed that wild-type ACE2 is targeted effectively to the plasma membrane approximately within 10 hours post-transfection, as demonstrated by cycloheximide chase assays. Although at least three of the naturally occurring ACE2 variants (R768W, G575V, and G173S) were predicted to be deleterious, none of the examined 38 genetic generated variants showed significant effects on the protein’s intracellular trafficking or targeting to the plasma membrane; in fact, only one mutant disrupting the signal peptide led to total loss of plasma membrane trafficking and targeting. Small molecules and drugs screening results showed that ACE2 maturation is generally fast and robust, with certain compounds having mild impact on its maturation. In particular, out of twenty-three tested compounds, eight significantly reduced ACE2 maturation levels, and three caused approximately 20% decrease. Screening trafficking inhibitors revealed significant effects for most molecular modulators of protein trafficking, mild effects for most proposed COVID-19 drugs, and no effects for statins. Noting that manipulating ACE2 levels could be beneficial or harmful, depending on the context. Thus, using this approach to uncover leads for COVID-19 therapeutics requires a thorough understanding of ACE2 biogenesis and biology.

In the context of B0AT1, I evaluated the subcellular localization of 18 Hartnup disease-causing variants and found 9 of them (R57C, G93R, R95P, R178Q, L242P, G284R, S303L, D517G, P579L) to be retained in the endoplasmic reticulum (ER), disrupting the protein’s maturation and consequently affecting ACE2 localization to varying degrees. Notably, R178Q and S303L B0AT1 mutations had significant impacts on ACE2 intracellular trafficking and plasma membrane targeting. In conclusion, this study advanced our understanding of the molecular mechanisms governing ACE2 and B0AT1 biogenesis and some of their interplay in health and disease. By identifying key variants and modulators that influence these processes, this research may contribute to the development of targeted therapeutic strategies and biomarker discovery. Future studies should further explore the clinical implications of these findings and investigate additional molecular modulators to mitigate disease progression and improve patient outcomes.

Arabic Abstract

توضيح دور (ACE2) في الصحة والمرض: التكوين الحيوي، المتغيرات، والتفاعلات مع (B0AT1)

يُعد (ACE2) و (B0AT1) من البروتينات الغشائية المتكاملة ذات الأدوار المهمة في فسيولوجيا الإنسان. يشارك (ACE2) في تنظيم ضغط الدم ويعمل كمستقبل لدخول فيروس (SARS-CoV-2) ، بينما يسهل (B0AT1) امتصاص الأحماض الأمينية في الأمعاء. تؤكد العلاقة المتبادلة بين (ACE2) و (B0AT1) ، ولا سيما تفاعلهما الفيزيائي والتعايش في الأمعاء، على أهميتهما في الفسيولوجيا الطبيعية والأمراض. تم ربط خلل تنظيم هذه البروتينات بحالات مثل (COVID-19) ، وارتفاع ضغط الدم، ومرض (Hartnup). ومع ذلك، لا تزال هناك فجوات معرفية فيما يتعلق بتأثير المتغيرات الطبيعية في (ACE2) والطفرات المرتبطة بالأمراض في (B0AT1) على تكوينهما الحيوي، وعمليات النقل داخل الخلايا، ودورهما في مسببات الأمراض. الهدف العام من مشروعي للدكتوراه هو معالجة هذه الفجوات المعرفية من خلال التحقيق في كيفية تأثير المتغيرات الجينية المحددة في (ACE2) و (B0AT1) على تموضعهما الخلوي، الإنقلاب الخلوي، والتفاعلات بينهما. لتحقيق ذلك، استخدمت نهجًا متعدد التخصصات يشمل الطفرات الموجهة بالموقع لإنشاء 39 متغيرًاطبيعيا و هيكلي ا ل (ACE2) و 18 طفرة مسببة للأمراض في (B0AT1) تم تحليل هذه المتغيرات باستخدام ال (Confocal Microscope) واختبارات حالة (N-glycosylation) لتقييم آثارها على التموضع الخلوي ونضج البروتين. كما تم إجراء تحليلات (In Silico) لتقييم التغيرات في تقارب الارتباط بين الوحدات الفرعية في المركب ال [(ACE2:B0AT1)] ، بالإضافة إلى اختبارات فحص الأدوية لاستكشاف الموديلات الجزيئية لنضج (ACE2) وإرتباطه بالفاروس حتى يدخل الخلية . أظهرت نتائجنا أن النوع السليم من (ACE2) يستهدف الغشاء البلازمي بعد حوالي 10 ساعات من التعبير، كما هو موضح في اختبارات مطارد (cycloheximide). تم توليد متغيرات جينية في (ACE2) الطبيعية المنشأ، بما في ذلك ثلاثة متغيرات تم التنبؤ بأنها ضارة (R768W ، G575V ، و G173S) ، والتي كانت منتشرة في مختلف الأعراق البشرية، وأظهرت جميع المتغيرات ال 38 عدم وجود تأثير كبير على نقل (ACE2) داخل الخلايا أو استهدافه للغشاء البلازمي عدا عن متغير واحد كان قد خسر الإشارة ناقلة عبر الخلية. حدد فحص الأدوية أن (Casin) بتركيز (5 μM) و (Panbinostat) بتركيز (10 μM) يعملان كمثبطات فعالة لنضج (ACE2) ، مما يقلل من توفره في الغشاء البلازمي وبالتالي يحد من دخول فيروس (SARS-CoV-2).

أما بالنسبة إلى (B0AT1) ، فقد تبين أن تسعة من الطفرات المسببة لمرض (Hartnup) (R57C ، G93R ، R95P ، R178Q ، L242P ، G284R ، S303L ، D517G ، P579L) يتم احتجازها في الشبكة الإندوبلازمية، مما أدى إلى اضطراب نضوجها وتأثيرها على تموضع (ACE2) بدرجات متفاوتة. وكان للطفرات (R178Q) و (S303L) تأثيرات كبيرة على نقل (ACE2) داخل الخلايا واستهدافه للغشاء البل ازمي.

تساهم هذه الدراسة في تعزيز فهمنا للآليات الجزيئية التي تحكم التكوين الحيوي ل (ACE2) و (B0AT1) وعلاقتهما المتبادلة في الصحة والمرض. من خلال تحديد المتغيرات الرئيسية والموديلات التي تؤثر على هذه العمليات، تسهم أبحاثي في تطوير استراتيجيات علاجية مستهدفة واكتشاف المؤشرات الحيوية. ينبغي أن تستكشف الدراسات المستقبلية الآثار السريرية لهذه النتائج والتحقيق في المزيد من العوامل الجزيئية للحد من تطور المرض وتحسين نتائج المرضى.

Download

Share

COinS