"IDENTIFICATION OF A POTENTIAL PR50GAG BINDING SITE CRITICAL FOR SELECT" by Anjana Krishnan

Date of Award

10-2023

Document Type

Dissertation

Degree Name

Doctor of Philosophy in Biomedical Sciences

Department

Medical Microbiology and Immunology

First Advisor

Tahir A. Rizvi

Second Advisor

Farah Mustafa

Abstract

Feline immunodeficiency virus (FIV) is an important lentivirus that causes acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) in cats, making FIV a potential small animal model for studying the pathogenesis of human AIDS. Furthermore, due to its phylogenetic distance from primate retroviruses like human immunodeficiency virus (HIV) and its ability to infect non-dividing cells, FIV is also being exploited for the development of vectors for human gene therapy. Therefore, it is of paramount importance that pertinent steps in the life cycle of FIV, such as genomic RNA (gRNA) packaging, are delineated at the molecular level. The process of retroviral gRNA packaging relies on crucial recognition event(s), wherein sequence(s) termed as packaging signal(s) on the gRNA intricately interact with the Gag polyprotein, orchestrating the selective packaging of gRNA from a pool of cellular and viral spliced RNAs. It is well established that sequences within the packaging signal adopt a number of conformational states and their interaction with Gag polyprotein could be either at the primary sequence or at the secondary structural level.

Previous studies have mapped the FIV packaging signal into two discontinuous regions within the 5’ end of the gRNA that assumes a higher order structure. Our focus in this study was to identify the minimum sequences required within these two discontinuous regions for FIV gRNA packaging which could act as FIV Gag precursor (Pr50Gag) binding site(s). The FIV Gag precursor Pr50Gag is the key player in the assembly of new viral particles as well as efficient selection/packaging of two copies of gRNA into the virus particles. As an initial step, a systematic mutational analysis of the previously identified core packaging determinants was carried out employing a biologically relevant FIV three plasmid genetic complementation assay. This mutational analysis revealed that a U85CUG88 motif in the 5’ region of FIV gRNA is crucial for its packaging into the nascently forming virus particles. To establish the secondary structure of FIV packaging signal RNA, High-throughput Selective 2' Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension (hSHAPE) was performed on wild type RNA which revealed that the U85CUG88 motif is part of a large loop that falls within a region that has earlier been shown to be indispensable for FIV gRNA packaging.

Next, towards identifying Pr50Gag binding site(s) on gRNA, FIV Gag sequences fused with His6-tagged were cloned in a prokaryotic expression plasmid and expressed in bacterial cells. Subsequently, the protein was purified from the soluble fraction through immobilized metal affinity chromatography (IMAC) followed by size exclusion chromatography (SEC). The functionality of the purified recombinant protein was ascertained by its ability to assemble in vitro into virus-like particles (VLPs). After having validated the structure of FIV packaging signal RNA, filter-binding assays were performed using purified FIV Pr50Gag on U85CUG88 mutants as well as on wild type gRNA. Filter binding assays revealed reduced levels of Pr50Gag binding to U85CUG88 mutant RNAs compared the wild type gRNA, suggesting that the U85CUG88 stretch is crucial for RNAPr50Gag interaction and functions as a potential Gag binding site. To exclude the possibility that the poor Gag binding in the case of U85CUG88 mutants was not because of structural changes, we performed hSHAPE analysis on U85CUG88 substitution mutants. The results indicated only minimal structural impact, confirming the significance of U85CUG88 sequence in the selective packaging and propagation of FIV gRNA. Furthermore, bandshift and band-shift competition assays suggest that the Pr50Gag-FIV gRNA interactions are more dynamic than interactions between other retroviral Gag precursor proteins and their cognate gRNAs. Delineating sequences important for FIV gRNA packaging should enhance our understanding of both gRNA packaging and assembly, making them targets for novel therapeutic interventions, as well as development of FIV-based vectors for human gene therapy.

Arabic Abstract

تحديد موقع الربط Pr50Gag الاساسي للتغليف الانتقائي للحمض النووي الريبي gRNA لفيروس نقص المناعة (FIV)

يعد فيروس نقص المناعة لدى القطط (FIV) أحد الفيروسات المهمة التي تسبب متلازمة نقص المناعة المكتسب (الإيدز) في القطط، مما يجعل FIV نموذجًا حيوانيًا صغيراً محتملاً لدراسة التسبب في مرض الإيدز البشري. علاوة على ذلك، نظرًا لبعده التطوري عن الفيروسات الارتجاعية الرئيسية مثل فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) وقدرته على إصابة الخلايا غير المنقسمة، يتم استخدام فيروس ال FIV أيضًا لتطوير نواقل للعلاج الجيني البشري. لذلك، من الأهمية أن يتم تحديد الخطوات ذات الصلة في دورة حياة ال FIV ، مثل تجميع الحمض النووي الريبي الجينومي (RNA)، على المستوى الجزيئي. تعتمد عملية تجميع الحمض الريبي النووي النقال (RNA) الفيروسي القهقري على حدث أو عدة أحداث متعاقبة، حيث يتفاعل التسلسل التسلسلات) الذي يطلق عليه إشارة (إشارات) التجميع في الحمض النووي الريبي (RNA) بشكل معقد مع بروتين Gag ، وينسق التعبئة الانتقائية للـ gRNA من مجموعة من الحمض النووي الريبي المقسم الخلوي او الفيروسي. لقد ثبت جيدًا أن التسلسلات داخل إشارة التجميع تعتمد على عدد من الحالات التوافقية ويمكن أن يكون تفاعلها مع بروتين Gag إما على التسلسل الأولي أو على المستوى الهيكلي الثانوي.

قامت الدراسات السابقة بتحديد إشارة التعبئة والتغليف لفيروس ال FIV في منطقتين متقطعتين داخل الطرف 5 من الحمض النووي الريبي (gRNA) والذي يفترض ان يكون على المستوى الهيكلي الثانوي. كان التركيز الاساسي في هذه الدراسة هو تحديد الحد الأدنى من التسلسلات المطلوبة داخل هاتين المنطقتين المتقطعتين لتغليف FIV gRNA والتي يمكن أن تكون بمثابة موقع (مواقع) ربط الخاصة بال (FIV Gag (Pr50Gag . يعد ال FIV Gag Pr50Gag هو اللاعب الرئيسي في تجميع الجزيئات الفيروسية الجديدة بالإضافة إلى الاختيار / التعبئة الفعالة لنسختين من ال gRNA في جزيئات الفيروس كخطوة أولية، تم إجراء تحليل طفري منهجي لمحددات التعبئة والتغليف الأساسية التي تم تحديدها مسبقا باستخدام مقايسة التكامل الجيني البلازميدي الثلاثية بيولوجيا. كشف هذا التحليل الطفري أن نموذج ال U85CUG88 الموجود في المنطقة 5 من FIV RNA يعد أمرًا بالغ الأهمية لتغليفه في جزيئات الفيروس الناشئة. لإنشاء البنية الثانوية لإشارة التعبئة والتغليف لل FIV RNA ، تم إجراء تحليل هيدروكسيل انتقائي عالي الإنتاجية ‘2 بواسطة (Primer Extension (hSHAPE على النوع البري للحمض النووي الريبي الذي كشف أن نموذج ال U85CUG88 هو جزء من حلقة كبيرة تقع داخل منطقة تم اثبات سابقا أنه لا غنى عنها لتغليف ال FIV gRNA. بهدف تحديد موقع (مواقع) ربط ال Pr50Gag على gRNA، تم استنساخ تسلسلات FIV Gag المندمجة مع علامة His6 في بلازميد وتم التعبير عنها في الخلايا البكتيرية. بعد ذلك، تمت تنقية البروتين من الجزء القابل للذوبان من خلال تحليل كروماتوجرافي تقارب المعادن المثبت (IMAC) متبوعا بكروماتوجرافي استبعاد الحجم (SEC). تم التأكد من وظيفة البروتين المؤتلف المنقى من خلال قدرته على التجمع في المختبر لتكوين جزيئات تشبه الفيروسات (VLPs). بعد التحقق من صحة بنية ال RNA لإشارة التغليف لفيروس ال FIV ، تم إجراء فحوصات ربط باستخدام FIV Pr50Gag المنقى على طفرات U85CUG88 وكذلك على gRNA من النوع البري. كشفت فحوصات الربط المرشح عن انخفاض مستويات ارتباط Pr50Gag بـ RNAs المتحولة U85CUG88 مقارنة بـ gRNA من النوع البري، مما يشير إلى أن امتداد U85CUG88ضروري لتفاعل RNA-Pr50Gag ويعمل كموقع ربط محتمل لـ Gag.

لاستبعاد احتمال أن يكون ربط ال Gag الضعيف في حالة طفرات ال U85CUG88لم يكن بسبب التغييرات الهيكلية، أجرينا تحليل hSHAPE على طفرات استبدال لل U85CUG88أشارت النتائج إلى الحد الأدنى من التأثير الهيكلي فقط، مما يؤكد أهمية تسلسل ال U85CUG88في التعبئة الانتقائية وانتشار ال FIV gRNA. علاوة على ذلك، تشير فحوصات المنافسة إلى أن تفاعلات Pr50Gag-FIV gRNA أكثر ديناميكية من التفاعلات بين بروتينات ال Gag الأخرى للفيروسات الارتجاعية و gRNAs المشابهة لها. يجب أن يؤدي تحديد التسلسلات المهمة لتعبئة FIV RNA إلى تعزيز فهمنا لكل من تعبئة وتجميع gRNA ، مما يجعلها أهدافًا للتدخلات العلاجية الجديدة، بالإضافة إلى تطوير ناقلات تعتمد على ال FIV للعلاج الجيني البشري.

Share

COinS