DELINEATING THE BINDING SITES OF MASON-PFIZER MONKEY VIRUS (MPMV) GAG PRECURSOR POLYPROTEIN (Pr78GAG) ON GENOMIC RNA FOR ITS SELECTIVE PACKAGING

Author

Fathima Nuzra Nagoor Pitchai

Date of Award

4-2021

Document Type

Dissertation

Degree Name

Doctor of Philosophy (PhD)

Department

Microbiology, Molecular Biology and Biochemistry

First Advisor

Professor Tahir A. Rizvi

Abstract

A key step in retroviral life cycle is the selective packaging of its dimeric RNA genome (gRNA) from a pool of cellular and spliced viral RNAs into nascent virions. This involves binding of the retroviral Gag polyprotein to sequences at the 5’ end of the viral genome, the packaging signal. The aim of this study was to identify full-length Gag polyprotein (Pr78^Gag) binding sites on Mason-Pfizer monkey virus (MPMV) gRNA, a promising candidate for the development of safe human gene therapy vectors. Towards this end, recombinant MPMV Pr78^Gag-His₆-tagged protein was cloned and expressed in bacterial cells, and purified from the soluble fraction using immobilized metal affinity chromatography (IMAC) followed by size exclusion chromatography (SEC). The biological activity of the purified protein was determined by its ability to assemble virus like particles (VLPs), while its ability to package MPMV specific subgenomic RNAs was confirmed in eukaryotic cells. Competitive band shift assays demonstrated preferential Pr78^Gag binding to unspliced over spliced viral RNA. Further competitive band shift assays were performed using mutants in two purinerich motifs consisting of a 16-nucleotide stretch of single-stranded purines (ssPurines; U¹⁹¹UAAAAGUGAAAGUAA²⁰⁶) and a partially base-paired purine-rich region (bpPurines; G²⁴⁶AAAGUAA²⁵³), previously found to be important for MPMV gRNA packaging. To map the precise Pr78^Gag binding sites on the MPMV gRNA, in vitro Gag-RNA foot-printing experiments followed by high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (hSHAPE) were performed. These revealed that Pr78^Gag binds to ssPurines, and the A²⁵²AGUGUU²⁵⁸ loop, corresponding to two unpaired adenosine residues of the bpPurines and the adjacent region called the “GU-rich region” (G²⁵⁴UGUU²⁵⁸), both of which flank the major splice donor. Hence, ssPurines are present on both the genomic and spliced viral RNAs, while the A²⁵²AGUGUU²⁵⁸ loop is found only on the gRNA, revealing how MPMV discriminates between genomic and spliced RNAs. Collectively, this study reveals how MPMV Pr78^Gag binds in a redundant fashion to the two single-stranded loops (ssPurines and the A²⁵²AGUGUU²⁵⁸ loop) to bring about selective gRNA packaging over spliced viral RNAs. These results should help in understanding virion assembly and facilitate development of safe and efficient retroviral vectors for human gene therapy.

Arabic Abstract

يعتبر التجميع الانتقائي هو أحد الخطوات الرئيسية في دورة حياة الفيروسات الارتجاعية لدمج المادة الوراثية للفيروس (الحمض النووي الريبوزي (gRNA)) من بين خليط من الاحماض النووية الريبوزية الخلوية والفيروسية لتكوين فيروسات جديدة. ويتضمن التجميع الانتقائي ارتباط البروتين الفيروسي Gas بالتسلسل الجيني المتواجد في النهاية 5’ من المادة الوراثية للفيروس، وهو ما يعرف بمحددات التجميع. ولقد كان الهدف من هذه الدراسة هو تحديد مواقع ارتباط البروتين الفيروسي Gas (Pr78^Gas) مع gRNA لفيروس القرد مايسون-فايز (MPMV) وهو فيروس مرشح للاستخدام في تطوير نواقل آمنة للعلاج الجيني في البشر. لتحقيق هذه الغاية، تم استنساخ البروتين الفيروسي Pr78^Gag-His₆ والتعبير عنه في الخلايا البكتيرية، ثم تنقيته من الجزء القابل للذوبان باستخدام كروماتوغرافيا تقارب أيوانات المعدن الثابت (IMAC) متبوعًا بكروماتوغرافيا الاستبعاد عن طريق اختلاف الحجوم (SEC). ولقد تم تحديد النشاط البيولوجي للبروتين المنقى من خلال إبراز قدرته على تجميع جزيئات شبيهة بالفيروسات (VLPs). في حين تم تأكيد قدرة هذا البروتين على جمع وتغليف جزيئات RNA الفرعية التابعة لفيروس MPMV في الخلايا حقيقية النواة. وأظهرت فحوصات تحول النطاق التنافسي ارتباط Pr78^Gag بجزيئات RNA الفيروسي غير المقسم على الأخص على الرغم من وجود جزيئات RNA المقسمة. وتم إجراء فحوصات تحول نطاق تنافسية أخرى باستخدام طفرات في مناطق غنية بالبيورين والتي تتكون من امتدادات لحوالي 16 نيوكليوتيد من البيورينات الأحادية (ssPurines; U¹⁹¹UAAAAGUGAAAGUAA²⁰⁶) ومنطقة غنية بالبيورين جزئياُ (ssPurines; G²⁴⁶AAAGUAA²⁵³) والتي تعرف بأهميتها في تجميع gRNA لفيروس الـMPMV. وللتعيين بدقة مواقع ارتباط بروتين ال Pr78^Gag على gRNAلفيروس الـMPMV، تم إجراء تجارب بصمة للمركب Gag-RNA متبوعة بتقنية الأسيلة الانتقائية ذات الإنتاج العالية لـ 2’ هيدروكسيل وتحليلها بواسطة hSHAPE. كشفت نتائج هذه التقنية أن بروتين Pr78^Gag يرتبط ب ssPurines، وحلقة الـA²⁵²AGUGUU²⁵⁸ ، وهي عبارة عن اثنين من بقايا الأدينوسين غير المتزاوجة من bpPurines والمنطقة المجاورة المسماة "بالمنطقة الغنية بال (G²⁵⁴UGUU²⁵⁸)" GU، وكلاهما يحيط بالمنطقة المانحة الرئيسة (major splice donor). وعلى ذلك، فإن ssPurines موجودة على كل من جزيئات gRNA (غير المقسمة) وجزيئات RNA مقسّمة تابعة للفيروس. بينما تقع حلقة A²⁵²AGUGUU²⁵⁸ فقط علىgRNA ، وهذا يظهر كيفية فرزالفيروس MPMV بين gRNA وجزيئات RNA المقسّمة. بشكل عام، تكشف هذه الدراسة كيف يرتبط بروتين فيروس MPMV Pr78^Gag إلى الحلقتين المفردتين (ssPurines وحلقة A²⁵²AGUGUU²⁵⁸⁾ للتمييز خلال الجمع والتغليف بين gRNA وجزيئات RNA الأخرى المقسمة. وتكمن أهمية هذه الدراسة في فهم تجميع الفيروسات وتسهيل تطوير ناقلات للجينات العلاجية من الفيروسات الارتجاعية للاستخدام الآمن والفعال في البشر.

Recommended Citation

Pitchai, Fathima Nuzra Nagoor, "DELINEATING THE BINDING SITES OF MASON-PFIZER MONKEY VIRUS (MPMV) GAG PRECURSOR POLYPROTEIN (Pr78GAG) ON GENOMIC RNA FOR ITS SELECTIVE PACKAGING" (2021). Dissertations. 175.
https://scholarworks.uaeu.ac.ae/all_dissertations/175