Date of Award

5-2015

Document Type

Dissertation

Degree Name

Doctor of Philosophy (PhD)

First Advisor

Professor Sherif M. Karam

Abstract

In the stomach, epithelial stem cells are responsible for glandular homeostasis and continuous production of four main cell lineages secreting mucus, acid, pepsinogen and hormones. While alteration in the proliferation and differentiation program of these stem cells is linked to the origin of gastric cancer, they represent an effective target for chemotherapy and a source for cell therapy or tissue engineering in cases of gastric mucosal damage or loss. The aims of this study were 1) to manufacture various forms of scaffolds using a biodegradable polymer (polycaprolactone), 2) to test the suitability of these scaffolds for growth of mouse gastric stem (mGS) cells, and 3) to evaluate whether this culture system could sustain exposure to acidic environment for possible future applications. Three forms of polycaprolactone scaffold were fabricated: nonporous, microporous and microfibrous. Scanning electron microscopy (SEM) and mechanical testing revealed some similarities between the microfibrous scaffold and extracellular matrix of mouse stomach wall. Examination of mGS cells seeded on different forms of scaffold for 3 days using SEM and calcein viability assay revealed their preferential growth on microfibrous scaffolds fabricated by electrospinning technique. Analysis of the growth pattern of mGS cells on microfibrous scaffolds following 3, 6, 9 and 12 days of culture using SEM and DNA PicoGreen assay demonstrated an initial increase in cell number, followed by reduction by days 9 and 12. To test whether this reduction was associated with cell differentiation, cryosections of cultured mGS cells on scaffolds were probed with gastric epithelial cell differentiation markers. On day 3, none of the markers bound to the cells. However by day 9, approximately, 50% of the cells bound to N-acetyl-Dvii glucosamine-specific lectin (Griffonia simplicifolia II) suggesting differentiation into gland mucous cells. This finding was confirmed by the expression of trefoil factor 2 using immunocytochemisty. In addition, gene expression analysis using quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) demonstrated that the expression of transcription factor SPDEF, required for differentiation of mucous cells, was gradually up-regulated with culture of mGS cells from 3 to 12 days. To test whether this 3D culture system could tolerate the acidic environment of the stomach, the mechanical/chemical integrity of microfibrous scaffolds and cultured mGS cells were studied at acidic pH (3.0 to 7.4) using tensile strength measurements, fourier transform infrared spectroscopy, calcein assay, and mRNA/protein expression analysis. The in vitro wound-healing assay was also used to examine effects of acidic pH on cell migration. RPMI culture media at pH 3.0 and 4.5 reduced the mechanical integrity of scaffolds and significantly inhibited cell viability by >70%. However, at pH 5.5 and 6.0, no significant change in cell viability and scaffold integrity was observed, but cell migration was inhibited by more than 50%. Interestingly, only after 3-day culture at pH 5.5, N-acetyl-Dglucosamine- specific lectin binding combined with significant up-regulation in the expression of SPDEF gene confirmed mucous cell differentiation. In conclusion, a 3D culture model of mGS cells using microfibrous PCL scaffold supporting their differentiation into gland mucous cells has been established. Reducing the pH value of culture media to 5.5 modulates proliferation/migration programs of mGS cells and speeds up their differentiation into mucous cells. This study provides important basic information for the possible use of mGS cells and microfibrous PCL scaffolds for future gastric tissue engineering studies and viii regenerative therapy of some stomach diseases involving gastric mucosal damage or loss.

Comments

في المعدة تعتبر الخلايا الجذعية مسؤولة عن توازن الغشاء الطلائي ومصدرا اساسيا لأرععة أنواع من الخلايا المفرزة للمخاط ، والحامض، انزيم الببسين، والهرمونات ويؤدي التغيير في تكاثر و تمييز هذه الخلايا إلى سرطان المعدة، إلا أن هذه الخلايا تمثل هدفا فعالا للعلاج الكيميائي ومصدرا لعلاج الخلايا أو هندسة الأنسجة في ععض الحالات المرضيه للغشاء المخاطي في المعدة. تهدف هذه الدراسة ل) 1( تصنيع أشكال مختلفة من الهياكل عاستخدام لدائن الكاعرولكتون,) 2( اختبار مدى فعالية هذه الهياكل لنمو الخلايا الجذعيه المعوية للفأر 3( تقييم مدى ثبات هذا النموذج عند تعرضه لبيئة حمضية لتقديم تطبيقات عملية محتملة لهذه ( ,(mGS) الدراسة في المستقبل. ثلاثة أشكال مختلفة من الهياكل القاعلة للتحلل قد تم إنشائها: هياكل غير مسامية، مسامية دقيقة، ليفيه دقيقة. و قد كشف المجهر الالكتروني و الاختبارات الميكانيكية عن ععض أوجه التشاعه عين الهياكل الليفية الدقيقة و الجدار المزروعة (mGS) لدراسة calcein viability assay المعوي للفأر. و عند استخدام المجهر الالكتروني و قد electrospinning على اشكال مختلفة من الهياكل لمدة ثلاثة أيام أن الهياكل الليفية الدقيقة المصنعة عتقنية اعطت نتائج افضل من غيرها من الهياكل. تم ملاحةة زيادة في معدل نمو هذه الخلايا DNA PicoGreen assay وعاستخدام المجهر الالكتروني و على هياكل الألياف الدقيقة في الايام 3 و 6 من الزراعة، و تلاها ععد ذلك انخفاض في عدد الخلايا و ذلك في اليوم 9 و 12 من الزراعة، و لمعرفة اذا ما كان هذا الانخفاض مرتبط عتمايز الخلايا تم تحضير الخلايا عالتجميد المقطعي تم مراقبة هذه الخلايا عاستخدام علامات حيوية خاصة عالتمايز الخلوي للخلايا المعوية. في اليوم الثالث من الزراعة للخلايا لم يتم ملاحةة أي ارتباط مع المؤشرات الحيوية، و لكن في اليوم 9 تم ملاحةة x N-acetyl-D-glucosamine-specific lectin (Griffonia أن 50 % من الخلايا ارتبطت مع مشيرة إلى أن هذه الخلايا تتمايز لتكوين الخلايا المخاطية. و قد تم اثبات ذلك عالكشف عن simplicifolia II) (qRT- و ذلك عاستخدام التحليل الكيميائي الخلوي المناعي. و عاستخدام trefoil factor الاظهار الجيني ل 2 يعد عاملا اساسيا للتمايز الخلوي للخلايا المخاطية SPDEF قد تم الكشف ان الاظهار الجيني للعامل PCR) . اعتداء من اليوم 3 الى اليوم 12 mGS و انه يتزامن مع ارتفاع معدل النمو للخلايا و لمعرفة مدى قاعلية تحمل الخلايا المزرعة للبيئة الحمضية للمعدة تم اختبار القدرة الميكانيكية و الكيميائية 3.0 )، وتم دراسة to في وسط حمضي حيث تبلغ نسبة الحموضة ( 7.4 mGS لهياكل الألياف الدقيقة و خلايا tensile strength measurements, fourier transform infrared spectroscopy, ذلك عاستخدام wound- وإضافة الى ذلك لقد تم استخدام .calcein assay, mRNA/protein expression analysis لدراسة التأثير الحمضي على هجرة الخلايا. لم يتم ملاحةة أي تغيير في التأثير الميكانيكي healing assay للهيكل و قدرة الخلايا على النمو في الوسط الحمضي 5.5 و 6.0 لكن تم منع الخلايا المهاجرة عنسبة 50 %. و N- لكن في اليوم الثالث فقط من الزراعة في الوسط الحمضي 5.5 تم ملاحةة وجود ارتفاع في معدل مؤكدا SPDEF مع ارتفاع معدل الةهور الجيني ل acetyl-D-glucosamine-specific lectin binding ارتباطه مع التمايز الخلوي للخلايا المخاطية. على هياكل الألياف الدقيقة تدعم التمايز الخلوي للغدة المخاطية وأيضا انخفاض mGS إن زراعة الخلايا المعدل الحمضي للوسط الزراعي ل 5.5 يغير من معدل النمو و هجرة الخلايا و يسرع معدل التمايز الخلوي لتكوين الخلايا المخاطية . تكمن اهمية هذه الدراسة في توفيرها المعلومات الاساسية لإمكانية استخدام الخلايا الجذعية و هياكل الألياف الدقيقة في هندسة الأنسجة و العلاج التجديدي في علاج ععض الأمراض المعوية التي تشمل حالات القرحه والسرطان للغشاء المخاطي في المعدة

Download

Included in

Anatomy Commons

Share

COinS