Date of Award

1-2023

Document Type

Dissertation

Degree Name

Doctor of Philosophy in Biomedical Sciences

Department

Medical Microbiology and Immunology

First Advisor

Gulfaraz Khan

Abstract

Epstein-Barr Virus (EBV)-Encoded RNAs (EBERs) are two small, noncoding, structurally conserved transcripts that are expressed in millions of copies in all stages of EBV infection. Despite their abundant expression, the role of EBERs in EBV biology or pathogenesis is not well defined. However, they are associated with driving cell proliferation and improving intercellular communication via their secretion in exosomes. In spite of the pathogenic potentials of EBERs, the mechanisms involved in their transport and function remain to be elucidated. The aim of this PhD dissertation was to investigate the structural impact of EBER1 in its transport and function. The conserved structure of EBER1 was disrupted by deleting sequences corresponding to stem-loop (SL) 1, 3 and 4 of the RNA, creating three mutants: ΔSL1, ΔSL3, and ΔSL4. These mutants were cloned onto pHebo plasmid and transfected into Jurkat and HEK293T cell lines. Cells transfected with wildtype EBER1 and pHebo were used as the positive and negative control, respectively. Cell proliferation was investigated by microscopy, flow cytometry, microarray, qRT-PCR, and Western blotting. EBER1 transport was studied by quantifying EBER1 expression in the whole cell, nuclear, cytoplasmic and exosomal fractions by qRT-PCR in the presence of physiological expression of RPL22 and La, and after their silencing using siRNA technique. Furthermore, intracellular Ca2+ was measured by microscopy and Western blotting. There was a significantly higher proliferation in cells transfected with wildtype EBER1 compared to pHebo, ΔSL1 and ΔSL3 but not ΔSL4 mutant. Similarly, markers of S-phase and G2/M phase were significantly upregulated in wildtype EBER1 and ΔSL4 mutant. Moreover, CDT1 was upregulated in these cells. In ΔSL1 mutant, however, CDT1 was significantly downregulated and translocated to the cytoplasm. Statistically, the structure of EBER1 had a significant impact on its induced cell proliferation (p=0.045). Similarly, EBER1 structure had an impact on its transport. Compared to wildtype, the level of EBER1 expression in all mutants was significantly lower in the whole cell, cytoplasmic and exosomal fractions. ΔSL3 mutant showed significant nuclear retention. Silencing RPL22 resulted in increased nuclear-cytoplasmic trafficking of EBER1. Nonetheless, silencing La protein did not affect the secretion of EBER1. As an alternative mechanism of EBER1 secretion, the intracellular Ca2+ signalling mediated by store-operated Ca2+ entry was found to be proportional to EBER1 expression in exosomes. To summarise, stem-loops 1 and 3 appeared to be involved in EBER1-induce proliferation and cellular transport, respectively. The molecular mechanisms of EBER1-induced cell proliferation involve upregulating and retaining the nuclear expression of CDT1. EBER1-RPL22 interaction is implicated in the nuclear localisation of the RNA. Finally, this study hypothesised that cytosolic Ca2+ could play a role in the secretion of EBER1 into exosomes.

Arabic Abstract


التأثير الهيكلي للحمض النووي الريبي RNA-1 المشفر الخاص بفيروس ال EPSTEIN-BARR على وظيفته وقدرته على النقل

الحمض النووي الريبي الخا ص بفيروس (Epstein-Barr -EBV) عبارة عن نسختين صغيرتين غير مشفرة ومحفوظة هيكليًا ويتم التعبير عنها بملايين النسخ في جميع مراحل عدوى ال (EBV) . وعلى الرغم من هذه الوفرة، فإن دورال (EBERs) في بيولوجيا ال (EBV) أو كيفية التسبب في المرض غير محدد بشكل جيد. ومع ذلك، فهي مرتبطة بتكاثر الخلايا الدافعة وتحسين الاتصال بين الخلايا من خلال إفرازها في ال (exosomes) . على الرغم من قدرة ال (EBERs) على التسبب بالأمراض، فإن الآليات التي ينطوي عليها انتشارها ونقلها لا تزال بحاجة إلى توضيح. كان الهدف من أطروحة الدكتوراه هذه هو التحقيق في التأثير الهيكلي ل (EBER1) في نقلها ووظيفتها. تم تعطيل البنية المحفوظة ل (EBER1) عن طريق حذف التسلسلات المقابلة للحلقة الجذعية (SL) 1 و 3 و 4 من الحمض النووي الريبي، مما أدى إلى إنشاء ثلاث طفرات: ΔSL1 و ΔSL3 و ΔSL4 . تم استنساخ هذه الطفرات على بلازميد (pHebo) وتمت دراستها في خلايا ال (Jurkat) و (HEK293T) . تم استخدام الخلايا المنقولة بالنوع الغير معدل (EBER1) و (pHebo) كعنصر إيجابي وسلبي، على التوالي. تم التحقيق في تكاثر الخلايا عن طريق الفحص المجهري، قياس التدفق الخلوي، (blotting (microarray)،(qRT- PCR)، و Western). تمت دراسة نقل (EBER1) عن طريق تحديد كمية تعبير (EBER1) في الخلية ككل، النواة، السيتوبلازم وأجزاء من ال (exosome) بواسطة (qRT-PCR) في وجود التعبير الفسيولوجي لكل من (RPL22) و (La)، وبعد نعطيلهما باستخدام تقنية (siRNA). علاوة على ذلك، تم قياس (Ca2+) داخل الخلايا عن طريق الفحص المجهري وال (Western blotting) . كان هناك انتشار أعلى بشكل ملحوظ في الخلايا المنقولة بالنوع غير المعدل (EBER1) مقارنة ب (pHebo) و (ΔSL1) و (ΔSL3) ولكن ليس (ΔSL4) . وبالمثل، كان هناك ارتفاع ملحوظ في دلالات طور (S) و (G2/M) بشكل كبير في (EBER1) غير المعدل و (ΔSL4) . علاوة على ذلك، فأن معدلات ال (CDT1) ارتفعت في هذه الخلايا. في ال ΔSL1 ، انفضت معدلات ال (CDT1) بشكل كبير وكذلك نقله إلى السيتوبلازم. إحصائيًا، كان لبنية (EBER1) تأثير كبير على تكاثر الخلايا المستحثة (p=0.045). كذلك ، كان لهيكل EBER1 تأثير على النقل. مقارنةً بالنوع الغير معدل، ان مستوى التعبير لل(EBER1) في جميع الطفرات أقل بشكل ملحوظ في الخلية بأكملها وكذلك السيتوبلازم وال (exosomes) . أظهر ال (ΔSL3) احتفاظًا نوويًا كبيرًا. أدى تثبيط ال (RPL22) إلى زياد ة معدلات التسريب بين السيتوبلاز م والنوا ة ل(EBER1) . ومع ذلك، فإن إسكات بروتين ال La لا يؤثر على إفراز (EBER1) . كآلية بديلة لإفراز ال (EBER1) تم العثور على إشارات (Ca2+ ) داخل الخلايا لتكون متناسبة مع تعبير (EBER1) في ال (exosomes) .الاستنتاج: يبدو أن الحلقات الجذعية 1 و 3 تعملان بشكل اساسي في تكاثر ال (EBER1) وكذلك النقل الخلوي على التوالي. تتضمن الآليات الجزيئية لتكاثر الخلايا الناجم عن ال (EBER1) ال تنظيم والاحتفاظ بالتعبير النووي ل (CDT1) . يعتبر تفاعل (EBER1-RPL22) مسؤول عن توطين للحمض النووي الريبي داخل النواة. أخيرًا، افترضت هذه الدراسة أن العصارة الخلوية Ca2+يمكن أن تلعب دورًا في إفراز (EBER1) في ال (exosomes).

Download

Share

COinS