ESTABLISHMENT OF ORGANOIDS FROM GASTRIC STEM CELLS AND THEIR USE TO STUDY THE ROLE OF ARYL-HYDROCARBON RECEPTORS
تعتبر الخلايا الجذعية أدوات قوية في جوانب مختلفة من البحوث الطبية الحيوية والتطبيقية، بما في ذلك نمذجة المرض، واختبار الأدوية، وهندسة الأنسجة للطب التجديدي. وم ذلك، فإن فصل وزراعة الخلايا الجذعية الخاصة بالأعضاء هي مهمة صعبة. لذلك، لم يتم دراسة السمات البيولوجية للعديد من الخلايا الجذعية البالغة بشكل جيد ولا يزال دورها في تطور السرطان مثير للجدل. تم إنشاء بعض خطوط الخلايا الجذعية الخالدة في معملنا وتم أيضا استخدامها كبديل لدراسة صفات الخلايا الجذعية الخاصة بالأعضاء. إن القدرة على نمو الخلايا في نظام نموذج ثلاثي الأبعاد D 3 الذي يشابه ظروف الجسم الحي من شأنها أن تساعد في الكشف عن المزيد والمزيد من خصائص الخلايا الجذعية.
في هذه الدراسة، تم إنشاء نوعين من نماذج ثلاثية الأبعاد لدراسة خصائص الخلايا الجذعية المعدية. في النموذج الأول، تم استخدام طريقة القطرة المعلقة لنمو الخلايا الجذعية المخلدة المشابهة لتلك الموجودة في الخلايا الجذعية في معدة الفئران. في غضون يوم، شكلت الخلايا كتلة مستديرة صغيرة في وجود RPMI التي تحتوي على 10 ٪ من مصل الدم دون إضافة كروي ينمو يوما بعد يوم بسبب تكاثر الخلايا و يمكن الحفاظ عليها لعدة أشهر و تم فحص هذه العضيات بالمجهر الإلكتروني. أما النوع الثاني من العضيات فقد تم إنشاءها من غدد المعدة الأولية المفصولة من معدة الفأر حديثً الولادة باستخدام مادة الماتريجل . تم تكوين العضيات في غضون يوم واحد وإستمر نموها لمدة تصل إلى 10 أيام. تم تحديد مساهمة الخلايا الجذعية و ديناميكياتها أثناء تكوين هذه العضيات باستخدام طرق معملية عديدة، و تم الكشف عن أدلة لتمايز هذه الخلايا لتصبح منتجة لمخاط المعدة.
لاستخدام نموذج عضيات المعدة لدراسة دور مستقبلات أريل الهيدروكربونية (AhR) ‘ وهى أحد العوامل الهامة التي تسيطر على الخلايا الجذعية وكذلك تشارك في التسبب في سرطان المعدة تم اختبار مستويات التعبير عنها أولاً باستخدام الكيمياء المناعية على الأنسجة. كشفت النتائج أن بعض خلايا أعضاء المعدة تحتوى على AhR ، و تم تأكيد هذه النتائج أيضًا بواسطة qRT-PCR في أنسجة المعدة لدى الفئران والجرذان والإنسان. توجد هذه الخلايا التي تحتوى على AhR في منتصف الغدد المعدية حيث توجد الخلايا الجذعية وأظهرت التعبير السيتوبلازمي والنووي. لتنشيط AhR ، تمت معالجة عضيات بعمر يومين مع 0.1 و 1. نانومولر من الديوكسين لمدة يومين. كشفت النتائج عن زيادة تنظيم السيتوكروم P450 الذي يؤكد نجاح تنشيط .AhR كان هناك أيضًا زيادة في Oct-4 الذي يعزز التجديد الذاتي للخلايا الجذعية المعدية. تم دعم وتطبيق هذه النتائج من خلال دراسة كل من AhR و Oct-4 في أنسجة السرطان في المعدة.
في الختام، هذه الدراسة ساعدت على إنشاء عضيات المعدة وتم استخدامها لدراسة الصفات البيولوجية للخلايا الجذعية في المعدة و للتعرف على دور AhR في التجديد الذاتي للخلايا الجذعية وبالتالي يمكن استخدامها في المستقبل في هندسة و زراعة أنسجة المعدة و يمكن تطبيقها على أبحاث لهدف تشخيصي و/أو علاجي لمرضى سرطان المعدة.
Abstract
Stem cells are powerful tools in different aspects of biomedical and translational research, including disease modelling, drug testing, and tissue engineering for regenerative medicine. However, isolation and culture of organ-specific stem cells are challenging tasks. Therefore, the biological features of many adult stem cells are not well studied and their involvement in the development of cancer is still controversial. Some immortal stem cell lines have been established and used as an alternative to studying features of organ-specific stem cells. The ability to grow cells in a scaffold-free, three-dimensional (3D) model system that mimics in vivo conditions would help in revealing more and more properties of stem cells.
In this study, two types of 3D culture models were established to define specific properties of gastric stem cells. In the first model, the hanging drop method was used to grow immortalized mouse gastric epithelial progenitor/stem (MGS) cells with molecular and morphological features similar to those of stomach stem cells. Within a day, MGS cells hanging in RPMI media containing 10% serum without adding any growth factors formed a small cluster. By day 2, when transferred onto the surface of agarose using the same media, each cell cluster developed into a small spherical organoid with a central lumen, characterized by electron microscopy. Due to cell proliferation, these organoids progressively grew in size and were maintained for six months. The second type of organoids was developed from incipient gastric glands freshly isolated from neonatal mouse stomachs using the matrigel method. Organoids were developed within a day and were maintained for up to 10 days. The stem cell contribution and cellular dynamics during the formation of these organoids were investigated using bromodeoxyuridine labelling. Organoids were further characterized at different time points by using calcein-propidium iodide labelling, electron microscopy, lectin histochemistry, immunohistochemistry and quantitative reverse-transcription polymerase chain reactions. Evidence of differentiation into gastric mucus-producing epithelial cells was detected.
To use the gastric organoids as a model for investigating the role of aryl-hydrocarbon receptors (AhR), one of the important factors involved in stem cell control as well as in the pathogenesis of cancer. Their expression levels were first tested using immunohistochemistry. Data revealed the localization of AhR in MGS cells and cells forming the gastric primary organoids. These findings correlated with the cellular expression of AhR in gastric mucosa of mice, rats and humans. Immunolabeled cells were located in the middle of gastric glands where dividing stem cells are located. To test the consequences of AhR activation, two-day-old organoids were incubated with 0.1 and 1.0 nM of dioxin for two days. Upregulation of cytochrome P450 indicated activation of AhR. This was associated with upregulation of Oct-4 expression which suggested enhancement of self-renewal of gastric stem cells. Similar findings were observed in human gastric precancerous and cancer tissues.
In conclusion, gastric organoids are useful models to study the regulation of gastric stem cells. Activation of AhR plays an important role in gastric stem cell self-renewal via Oct-4 upregulation. This could also explain the role of AhR in gastric cancer development. This study provides new insights into gastric stem cells which help in better understanding of their roles in tissue engineering and gastric cancer.